羟丁基几丁糖膜修复兔硬脑膜缺损的实验研究

刘国辉魏长征侯春林*

硬脑膜是脑组织表面重要的组织结构，由内外两层组成，是保护脑组织及储存脑脊液的重要屏障。在神经（脊柱）外科中，保持硬脑膜的完整对于颅脑（脊柱）手术患者意义重大。肿瘤、外伤及手术本身等均可造成硬脑膜的缺损[1]。修复硬脑膜缺损对减少颅内感染、脑脊液漏和脑组织的瘢痕形成至关重要[2]。目前，临床上应用的硬脑膜的替代材料很多，但没有一种材料能够达到理想的硬脑膜缺损修复要求而没有相应的并发症，所以对于硬脑膜替代材料的探索也一直在进行。刘双利及周霖等[3-4]实验研究均验证了羟丁基几丁糖凝胶即时封堵脑脊液漏的巨大潜力。本实验的目的是探索羟丁基几丁糖膜修补硬脑膜缺损远期的效果及可行性。

羟丁基几丁糖为几丁糖的衍生物，具有良好的生物相容性，制备成膜具有高韧性、多孔结构、可在生理缓冲溶液中保存等特点。力学性能测试显示该膜在干燥状态下呈现出一种极高的拉伸强度，浸润的湿态下呈现出一种较好的拉伸韧性，其拉伸长度可到达自身长度的4倍左右，可用于硬脑膜缺损的修复。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 羟丁基几丁糖膜的制备

在选定的模具底部及周边区域，用一定浓度的明胶溶液进行涂膜，低温或室温条件下放置待凝，向模具中注入一定体积的温敏性几丁糖溶液（注入前温敏性几丁糖溶液应在冰箱中保存或预冷），室温或40℃左右烘箱中静置待凝，将该水凝胶连同模具一同放入预先加热好的PBS水浴中进行脱胶。将凝胶转移至新鲜的PBS溶液中密封，水浴放置24h，使凝胶充分进行相转变。第二天，取膜，去离子水漂洗30 min，放入特定模具中，铺平，进行冷冻干燥。将冻干后的海绵裁剪后用PBS浸润，放入装有PBS的西林瓶中，密封后121℃高压灭菌 15 min，即得[5]。天义福（DuraMax）人工硬脑膜（简称生物膜）：牛肌腱Ⅰ型胶原。成分为牛肌腱Ⅰ型胶原，牛肌腱Ⅰ型胶原由胶原纤维构成，胶原纤维相互缠绕形成网状结构[6]。

1.1.2 羟丁基几丁糖膜的结构

大体观察羟丁基几丁糖膜为半透明胶体状膜（见图1），质地柔软，其拉伸韧性较强，扫描电镜下观察羟丁基几丁糖膜横切面（见图2）及纵切面（见图3）均为网状结构，故由此可知羟丁基几丁糖膜立体结构为蜂窝状。

图1 羟丁基几丁糖膜大体观察

图2 羟丁基几丁糖膜横切面结构（SEM）

图3 羟丁基几丁糖膜纵切面结构（SEM）

1.2 实验动物

取普通健康成年新西兰兔15只（由海军医学研究所动物房提供），雌雄不限。所有实验动物的饲养及实验环境均达到实验动物标准，实验过程的处置符合人道主义的标准，并符合本院伦理委员会的相关要求。

1.3 实验方法和分组

兔耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠（1.2～1.5 mL/kg）静脉麻醉，术前使用磺苄西林钠静脉注射预防感染，麻醉成功后头顶剃毛、固定，常规消毒头部皮肤，取颅中线正中切口长约5 cm，切开头皮、骨膜，暴露颅骨，颅中线两侧对称造成两1.2 cm×1.2 cm颅骨缺损，暴露硬脑膜，两侧各对称造成0.8 cm×0.8 cm硬脑膜缺损，左侧使用羟丁基几丁糖膜覆盖硬脑膜缺损（实验组），右侧使用生物膜覆盖缺损（对照组），依次缝合切口，术后观察动物饮食、活动及伤口情况，术后1周拆线。

1.4 取材

术后30、90、180 d对动物进行取材，各个时间点空气注射法处死5只动物，沿原切口切开，显露双侧原硬脑膜缺损处，观察植入材料与周围组织情况，新生组织与脑组织粘连情况，取手术区域组织固定于10%福尔马林溶液中，石蜡包埋HE染色。

1.5 观察指标

术后30、90、180 d，各时间点实验组、对照组及未手术区域正常硬脑膜每个标本取1张HE染色切片，200倍镜下各取3个视野，行成纤维细胞计数，取均值。

1.6 统计学方法

采用 SPSS 23.0软件进行统计学分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本 检验；检验水准 =0.05，＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 术后大体观察

实验动物术后状态良好，正常进食，未见肢体瘫痪、大小便失禁等神经症状，术后伤口愈合良好，未见感染，术后7 d拆线。

术后30d：双侧手术区域均未见明显炎症反应，见对照组生物膜被周围组织包绕，与周围界限不清，可见大部分被吸收，生物膜及周围新生组织覆盖脑组织，与脑组织未见明显粘连；实验组羟丁基几丁糖膜与周围组织无明显粘连，膜颜色变成淡黄色，膜容易取出，膜下可见新生膜覆盖脑组织，新生膜与脑组织无粘连。

术后90 d（见图4）及180 d对照组生物膜结构消失，已被完全吸收，对照组生物膜周围增生组织覆盖脑组织，与脑组织粘连，脑组织表面血管清晰可见，未见脑组织表面瘢痕形成，脑组织颜色未见明显异常；实验组羟丁基几丁糖膜与周围组织无明显粘连，膜颜色变成棕黄色，膜容易取出，未见膜被吸收迹象，膜下可见新生膜覆盖脑组织，实验组新生膜半透明，与脑组织无明显粘连，脑组织表面血管清晰可见，脑组织表面未见瘢痕形成，脑组织颜色未见明显异常。术后90 d及180 d，双侧手术区域均未见慢性炎症反应。

2.2 组织学观察

术后30d羟丁基几丁糖膜下新生膜：镜下可见大量成纤维细胞，成纤维细胞周围大量胶原纤维。术后30 d生物膜及其周围组织：镜下可见成纤维细胞增殖，成纤维细胞密度较羟丁基几丁糖侧低，可见大量脂肪细胞，细胞排列紊乱。

术后90d羟丁基几丁糖膜下新生膜：新生膜中成纤维细胞明显减少，可见大量胶原纤维，胶原纤维排列整齐，与正常兔硬脑膜相似性高（见图5）。术后90 d生物膜及其周围组织：成纤细胞数较前减少，仍可见大量脂肪细胞。

术后180 d羟丁基几丁糖膜下新生膜中成纤维细胞进一步减少，胶原纤维排列整齐，与正常兔硬脑膜相似性高。术后180 d人工硬脑膜下新生膜：成纤维细胞少，可见大量脂肪细胞，与正常兔硬脑膜相似性低（见图6）。

图4 术后90 d大体观察，a为对照组新生硬脑膜，b为实验组新生硬脑膜，c为未被吸收的羟丁基几丁糖膜

图5 正常兔硬脑膜HE染色（×200）

图 6 术后 30、90、180 d新生膜 HE 染色（×200）

术后 30 d实验组与对照组成纤维细胞计数分别为（355.66±10.09）、（259.96±14.29）个/视野，两组比较差异有统计学意义（=10.724，＜0.001）；术后180d实验组与正常兔硬脑膜成纤维细胞计数分别为（171.98±20.29）、（180.62±11.90）个/视野，两组比较差异无统计学意义（t=-0.72，=0.492）。术后 180 d对照组成纤维细胞计数为（118.00±18.57）个/视野，与正常兔硬脑膜比较，差异有统

表1 实验组和对照组新生膜中成纤维细胞计数

3 讨论

硬脑膜是覆盖在中枢神经系统表面的脑膜的最外层，它是由胶原纤维、成纤维细胞以及平行排列的弹力纤维组成的结缔组织[7]。硬脑膜可能因外伤或者肿瘤的切除而受损[8]，硬脑膜缺损可导致脑脊液漏、颅内积气、头痛、恶心、呕吐、硬膜下出血、假性脑脊膜膨出、脑膜炎等并发症。因此，修复硬脑膜缺损十分重要。

目前，用于硬脑膜缺损治疗或者研究探索的材料主要分为5类：自体组织；同种异体组织；动物来源天然组织；动物组织衍生；人工合成材料 [9]。尽管自体组织移植避免了免疫排斥的问题[10]，但是它们存在防水性能欠佳、疤痕组织的形成，以及移植材料的取材有限等问题，只能用于小的硬脑膜缺损，不适应于大的硬脑膜缺损或者多个小的硬脑膜缺损[11]。同种异体材料、生物复合材料存在动物病原体的传播、低机械强度以及免疫反应等问题[12]。人工合成材料不会传染疾病，不会导致粘连，且可以很容易地加工成所需的形状和尺寸，而且原材料相对充足，价格相对便宜[13]。人工合成材料用于硬脑膜修复具有广泛的前景。理想的硬脑膜修复替代材料应具有以下特点：生物安全性良好，无排斥反应；能够防止脑脊液漏；不与脑组织粘连；远期有新生膜形成；远期能够吸收；材料容易获取，来源广泛[14-17]。

羟丁基壳聚糖是一种无细胞毒性、无急性溶血、无全身急性毒性反应、组织相容性良好的生物材料[18]。羟丁基几丁糖膜由羟丁基几丁糖采用明胶相变涂层的方式脱膜而制成，其力学性能较羟丁基壳聚糖凝胶有很大改善，其力学性能可达到理想硬脑膜替代材料的要求，同时该材料具有几丁糖类似的防粘连性能[19-20]。

本研究首先研究了人工硬脑膜和羟丁基几丁糖膜的微观结构，人工硬脑膜具有由胶原纤维相互不规则缠绕形成的网状结构，羟丁基几丁糖膜具有蜂窝状的立体结构，两种结构都具有较多的孔隙作为细胞生长的支架。同时观察了羟丁基几丁糖膜作为硬脑膜修补材料的远期效果，实验结果表明，羟丁基几丁糖膜下有新生膜形成，新生膜与膜下脑组织未见粘连，羟丁基几丁糖膜与周围组织无粘连，容易取出。HE染色结果显示术后30d时新生膜中可见大量成纤维细胞，成纤维细胞计数与对照组比较，差异有统计学意义。成纤维细胞（fibroblast，FB）是主要的修复细胞，是创伤修复的工程师、建筑者和管理员[21]，Schick等[22]实验表明参与硬脑膜修复的主要是成纤维细胞。对硬脑膜创面加入成纤维细胞生长因子，硬脑膜创面愈合加速；早期成纤维细胞大量增殖有利于硬脑膜的修复；术后30 d，实验组HE染色观察成纤维细胞数量多，分泌大量胶原纤维，组织质密，对照组组织疏松，成纤维细胞数目相对少，分泌胶原纤维量少，而胶原纤维是硬脑膜主要组成部分，实验组胶原纤维分泌多表明硬脑膜修复旺盛。实验组成纤维细胞计数较对照组占据数量上优势，两组比较差异有统计学意义，这也许是实验组组织质密的主要原因。术后180 d，羟丁基几丁糖膜下新生膜中成纤维细胞计数明显减少，与正常兔硬脑膜成纤维细胞计数比较，差异无统计学意义，新生膜HE染色下结构与兔正常硬脑膜相似性高。术后180 d，生物膜组成纤维细胞计数较正常硬脑膜少，两者比较差异有统计学意义，生物膜组组织疏松，较正常兔硬脑膜相似性低。

综上所述，羟丁基几丁糖膜修复兔硬脑膜缺损，膜下有新生膜形成，早期成纤维细胞增殖促进组织修复，晚期成纤维细胞数量减少，术后180d与正常兔硬脑膜比较成纤维细胞数量差异无统计学意义，新生膜与兔正常硬脑膜相似性高，可以达到修复硬脑膜缺损的要求。