铁皮石斛多糖不同分级组分对小鼠免疫调节及肠道健康的影响

张珊珊 童 微 胡婕伦 黄晓君 殷军艺 聂少平

（南昌大学食品科学与技术国家重点实验室 南昌 330047）

铁皮石斛为兰科石斛属植物，因其铁绿色外皮而得名，又名铁皮兰、龙头凤尾草，主要分布在我国安徽、福建、浙江、广西和云南等地[1]。铁皮石斛是一种名贵的中草药，常用于治疗口干舌燥、目暗不明、胃阴不足、阴虚火旺、筋骨无力等症状，其鲜茎可泡茶、炖汤，亦可直接食用，是一种药食两用的植物。因其具有滋阴清热、美容养颜、延缓衰老、提高免疫力等功效，在民间被称为 “救命稻草”，且拥有“药中黄金”的美名[2]。研究表明[3]，铁皮石斛中化学成分多种多样，主要包括多糖、生物碱、氨基酸及其它一些微量元素，其中多糖含量丰富，是最主要的活性物质，具有良好的药效。药理研究表明，铁皮石斛多糖具有降血糖、抗肿瘤和免疫调节等多种功效[4-6]。近年来，多糖的免疫调节与肠道健康功能备受关注，而关于多糖不同分级组分的相关研究较少。本试验中采用梯度醇沉的方法对铁皮石斛多糖进行分级处理，以得到不同分子质量的多糖组分，并将铁皮石斛多糖不同分级组分作用于环磷酰胺诱导的免疫低下小鼠模型[7]，探讨铁皮石斛多糖不同分级组分对免疫抑制小鼠的免疫调节及肠道健康影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

铁皮石斛干茎购自云南金九地生物科技有限公司。

环磷酰胺（批号：07112221），江苏恒瑞医药股份有限公司；IFN-γ、IL-4、IL-6、TNF-α ELISA 试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司；IgE试剂盒，武汉优尔生公司；短链脂肪酸（乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸和异戊酸）标品，Sigma公司。

1.2 仪器与设备

3K15高速冷冻离心机，德国Sigma公司；METTLER TOLEDO XS105电子分析天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；FE-20 pH计，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；HPSEC-MALLS色谱系统，美国 Wyatt Technology公司；Varioskan Flash全波长多功能酶标仪，美国Thermo公司；Agilent 6890N气相色谱系统，Agilent公司。

1.3 动物

BALB/c 小鼠，雌性，SPF 级，体重（20±2）g，采购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，合格证号为 SCXK（湘）2011-0003。

1.4 试验方法

1.4.1 铁皮石斛多糖的分离、纯化与分级 参考文献中的多糖提取方法[8]，通过传统的水提醇沉法提取铁皮石斛多糖。取干燥的铁皮石斛干茎并粉碎到适宜的粒度，加入正己烷后搅拌48 h，再加入95%乙醇溶液搅拌48 h，离心后收集残渣，向其中加入40倍质量的去离子水，于70℃下提取3 h，离心，收集上清液。将上清液真空浓缩，醇沉，离心，收集沉淀。沉淀加去离子水复溶后，经冻干得到铁皮石斛粗多糖 （Crude polysaccharides of Dendrobium Officinale，DOC）。再通过 α-淀粉酶酶解、多次冻融离心与透析等方式以达到纯化目的，得到铁皮石斛精多糖 （Purified polysaccharides of Dendrobium Officinale，DOP）。

采用梯度醇沉法对铁皮石斛精多糖进行相对分子质量的分级处理。称取10 g DOP溶于1 L去离子水中，形成1%的多糖溶液，向其中缓慢滴加无水乙醇并搅拌，形成30%乙醇体积分数的混合物，静置 12 h，冷冻离心 20 min（4℃，10 000×g），沉淀复融冻干后得到F30组分。收集离心后的上清液，向其中缓慢滴加无水乙醇直到乙醇体积分数为40%，静置12 h，同样条件下冷冻离心20 min，沉淀复融冻干后得到F40组分。同样，再收集上清液，滴加无水乙醇直到乙醇体积分数达到50%，沉淀复融冻干后得到F50组分。最后将离心后收集的上清在60℃下旋蒸，冻干后得到F50S组分。利用高效阴离子交换色谱层析法测得DOP及分级组分（F30、F40、F50和 F50S）主要由甘露糖和葡萄糖组成，其组成比例为 5.16∶1，3.67∶1，4.16∶1，5.62∶1和 5.86∶1，利用分子大小排阻色谱法测得其平均分子质量大小分别为262.4，314.5，248.3，202.9和 136.2 ku。

1.4.2 试验动物分组与处理 所有小鼠适应性饲养7 d后随机分成8组，每组12只，分别为空白对照组（正常组）、免疫抑制模型组（模型组）、阳性对照组、DOP组和4个多糖分级组。除空白对照组之外，其余各组小鼠第1，2，3天均腹腔注射环磷酰胺80 mg/kg，建立免疫抑制小鼠模型。造模后，阳性对照组灌胃香菇多糖水溶液 （160 mg/kg），各铁皮石斛多糖组分别灌胃相应多糖 （160 mg/kg），连续灌胃7 d。空白对照组、模型对照组给予等体积的生理盐水，每天观察并记录各组小鼠体重的变化。

1.4.3 计算小鼠胸腺指数 末次给药24 h后，称重，颈椎脱臼处死小鼠并取出胸腺，用0.9%的NaCl溶液清洗后吸去多余NaCl溶液，再次称重，以胸腺（mg）与体重（g）的比值表示胸腺指数。

1.4.4 血清细胞因子与免疫球蛋白含量的测定末次给药24 h后，摘除眼球取血，室温放置2 h，离心并收集血清。参考ELISA试剂盒说明书进行操作，测定 IFN-γ、TNF-α、IL-6和 IgE 的含量。

1.4.5 脾脏中细胞因子含量的测定 取适量脾脏组织，用磷酸盐缓冲液制成10%的组织匀浆，离心20 min（4℃，3 000 r/min），收集上清液，保存于-80℃冰箱中备用。参考ELISA试剂盒说明书进行操作，测定IL-4、IFN-γ的含量。

1.4.6 小鼠肠道pH值与短链脂肪酸（Short-chain fatty acids，SCFA）含量的测定 取结肠内容物样品100 mg左右，用1∶7比例的去离子水进行稀释，多次间歇性涡旋与冰浴超声后，静置20 min，离心 20 min（7 800×g），收集上清并过膜，用于测定粪便pH值和SCFA含量。SCFA标准品包括乙酸、丙酸、丁酸和戊酸，按本实验室前期建立的分析方法进行气相色谱分析[9]。

1.4.7 小鼠粪便含水量的测定 在小鼠处死前收集粪便。将收集到的粪便样品置于 （105±2）℃烘箱，干燥至恒重，再置于干燥器中冷却至室温，称重。记录干燥前后的粪便质量，差值即为水分含量。每个样品测定3次平行。

1.4.8 统计分析 所有样品进行3次平行测定，试验数据采用x±S表示，采用SPSS 19.0软件进行数据统计分析，并进行t检验，分析各组间显著性差异。

2 结果与分析

2.1 铁皮石斛多糖不同分级组分对小鼠胸腺指数的影响

胸腺是机体中重要的免疫器官，是T细胞分化、成熟的场所，对机体的免疫调节起着重要作用[10]，胸腺指数的高低可以在一定程度上体现机体的非特异性免疫能力。由表1可知，注射了环磷酰胺的模型组小鼠胸腺指数大幅下降，显著低于正常组小鼠，说明环磷酰胺可以抑制小鼠的免疫功能，因此该免疫抑制模型造模成功。相比于模型组，F40和F50的胸腺指数均无显著变化，而其它各组胸腺指数均大幅增加，表明F40和F50对改善免疫低下小鼠的免疫功能不明显，而其它多糖组分则有显著改善作用；与DOP组分相比，F40、F50和F50S改善免疫功能的作用均较DOP弱，而F30对改善免疫作用与DOP组分相当。

表1 各组小鼠胸腺指数测定结果Table1 Effects of polysaccharides fractions from Dendrobium officinale on thymus index of mice

2.2 铁皮石斛多糖不同分级组分对小鼠血清中IFN-γ、TNF-α、IL-6和 IgE 含量的影响

铁皮石斛多糖不同分级组分对小鼠血清中IFN-γ、TNF-α、IL-6和 IgE含量测定结果如表2所示。由表2可知，与模型组相比，DOP、F30、F40、F50和F50S对TNF-α和IL-6含量均有显著的促进作用，对于 IFN-γ和 IgE 的分泌，DOP、F40、F50和F50S对免疫抑制小鼠IFN-γ的分泌具有显著的促进作用，却对IgE的分泌有一定的抑制作用。与DOP组分相比，对于IFN-γ的分泌，F30、F40和F50均较DOP组分弱，而F50S较DOP强且有明显的促进作用；对于TNF-α的分泌，F30、F40、F50和F50S均无显著变化；而对于IL-6的分泌，F40对IL-6的分泌作用较DOP明显降低，F30、F50和F50S与DOP的作用效果相当。

Th细胞是初始的CD4+T细胞，因功能不同分化为不同亚型，如Th1型和Th2型[11]。其中，Th1型细胞主要分泌 IL-2、IFN-γ、TNF-α和 TNF-β等细胞因子，参与细胞免疫应答，抵抗细菌、病毒感染；Th2 型细胞主要分泌 IL-4、IL-5、IL-6、IL-9等细胞因子，刺激B细胞增殖并产生抗体，参与体液免疫反应并发挥重要作用[12]。为保证机体正常免疫功能和身体健康，Th1和Th2细胞通常处于平衡状态，若一方遭到破坏将打破平衡并发生“Th1/Th2平衡漂移”[13-14]。TNF-α和IL-6也是机体重要的免疫调节细胞因子，TNF-α是参与免疫应答和炎症反应的重要成员，在抗肿瘤中也发挥着重要作用[15]。IL-6主要由巨噬细胞、B细胞和T细胞分泌，与集落刺激因子共同作用于NK细胞以增强其裂解功能[16]。IgE主要由Th2型细胞及其分泌的细胞因子共同产生，在I型超敏反应中作为重要抗体发挥作用，由于Th1/Th2的平衡，Th1型的细胞因子IFN-γ通常会抑制其分泌[17]。由于IFN-γ会抑制IgE的分泌作用，当IFN-γ分泌增多时，IgE的分泌量将减少，与试验结果相符，除F30外，铁皮石斛多糖及其不同分级组分均能抑制IgE的分泌作用，且F30和F40较DOP组分的抑制作用明显减弱，而其它组分无明显差异，F50S与DOP作用效果相当。

2.3 铁皮石斛多糖不同分级组分对小鼠脾脏组织中IFN-γ和IL-4含量的影响

由表3可知，与模型组相比，对于IFN-γ的分泌，DOP、F50和F50S均显著增加，虽然F30和F40无显著变化，但仍呈现增加趋势；对于IL-4的分泌，F40组无显著变化，但仍呈现下降趋势，而其它多糖组分作用组均显著降低。与DOP组分相比，其它多糖组分与DOP作用相当，并无显著性差异。

IFN-γ属于Th1型细胞因子，能够促进Th1细胞的分化，介导多种免疫应答，增强细胞的毒性作用[18]。IL-4是Th2型细胞的特征型细胞因子，能促进嗜酸性粒细胞和肥大细胞的活化和生长，还可活化B细胞，并促使其增值、成熟，从而介导免疫应答[19]。此外，Th1与Th2型之间的平衡通常利用IFN-γ与IL-4的比值来判断[13]。本试验结果表明，铁皮石斛多糖及其不同分级组分均能抑制IL-4的分泌并促进IFN-γ的分泌，说明其能通过调节Th1与Th2型之间的平衡从而调节机体免疫，并使其向Th1型免疫偏移，对于改善免疫低下小鼠的免疫调节作用有一定的积极作用，这与其它大量研究[20-21]得出的植物多糖促使免疫类型向Th1型偏移结果一致。相对于DOP组分，其它组分对于调节IFN-γ与IL-4的分泌较弱，即向Th1型免疫偏移的效果较DOP不明显，但F50、F50S较F30、F40的偏移效果更好。

表2 铁皮石斛多糖分级组分对小鼠血清中IFN-γ、TNF-α、IL-6和IgE的影响Table2 Effects of polysaccharides fractions from Dendrobium officinale on IFN-γ，TNF-α，IL-6 and IgE on serum of mice

表3 铁皮石斛多糖分级组分对小鼠脾脏中IFN-γ和IL-4的影响Table3 Effects of polysaccharides from Dendrobium officinale on IFN-γ and IL-4 on spleen of mice

2.4 铁皮石斛多糖不同分级组分对小鼠粪便含水量的影响

粪便含水量的增加可以提高粪便体积，以形成松弛度适宜的粪便，有利于肠道健康[22]。铁皮石斛多糖不同分级组分对小鼠粪便含水量的影响如图1所示，与模型组相比，F50组的小鼠粪便含水量无显著变化，而其它多糖作用组粪便含水量均显著增加，表明DOP、F30、F40和F50S组分均能增强粪便的持水力，而F50组分无明显作用。与DOP组相比，F50组较DOP组的作用显著减弱，F30、F40和F50S组与DOP组的作用相当。

2.5 铁皮石斛多糖不同分级组分对小鼠结肠内容物pH的影响

铁皮石斛多糖不同分级组分对小鼠结肠内容物pH的影响如图2所示，与模型组相比，F30组对小鼠结肠内容物pH无显著变化，而其它多糖作用组均表现为显著降低，表明DOP、F40、F50和F50S组分均能降低小鼠结肠的pH值，利于小鼠肠道健康，而F30组分无显著作用。与DOP组分相比，F30和F40组分降低肠道pH值的作用较SCFA作为结肠上皮细胞的主要供能物质，能调节免疫细胞和上皮细胞的生长凋亡，且能抑制结肠炎与结肠癌[23]，另外，SCFA还能维持水电解质平稳，调节肠道菌群，改善肠道功能，因此对肠道健康有积极作用[24]。图3表示了各组小鼠结肠DOP组分弱，F50和F50S组分则与DOP组的作用相当。

图1 小鼠粪便含水量差异Fig.1 The differences in water content of mouse feces

图2 小鼠结肠内容物pH值的差异Fig.2 The differences in pH of mouse colonic feces

2.6 铁皮石斛多糖不同分级组分对小鼠结肠内容物SCFA含量的影响

内容物SCFA的含量变化。由图3可知，模型组小鼠结肠内容物SCFA含量均较正常组显著降低，而经多糖不同分级组分作用后含量有所变化。对于总短链脂肪酸的浓度水平变化，F30相对模型组无显著变化，但仍呈现增加趋势，而其它多糖分级组分作用组均显著增加。相比于模型组，由乙酸、丙酸、丁酸和戊酸浓度水平的变化可知，DOP和F50S组均显著增加；F30和F40可使丙酸的浓度水平显著增加，而乙酸、丁酸和戊酸则无显著变化；F50可使乙酸和丙酸的浓度水平显著增加，而丁酸和戊酸无显著性变化。总体而言，各多糖组分对于SCFA中乙酸和丙酸的影响较大，而对于丁酸和戊酸的影响较小。相比于DOP组，F30、F40、F50和F50S组对促进免疫抑制小鼠结肠内乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和总SCFA的产生作用均较DOP组弱，但F50S较其它分级组分对SCFA的产生作用更为明显。

图3 小鼠结肠内容物中短链脂肪酸的含量Fig.3 The content of short chain fatty acids in mouse colonic feces

3 结论

本研究通过建立环磷酰胺诱导的免疫低下小鼠模型，研究发现小鼠灌胃铁皮石斛多糖后，各组小鼠胸腺指数均有所增加，且DOP、F30和F50S组的胸腺指数相比于模型组显著增加。通过比较各分级组分多糖对小鼠细胞因子的分泌作用，发现各组分均能在一定程度上促进或抑制免疫抑制小鼠细胞因子的分泌，并与DOP的作用效果相当或效果更弱，而F50S对于促进IFN-γ的分泌作用较DOP显著增强。同时，铁皮石斛多糖不同分级组分均能在不同程度上增加粪便含水量，降低粪便pH值，提高SCFA浓度水平，相比于DOP，其它铁皮石斛多糖分级组分对于改善由环磷酰胺诱导的免疫低下小鼠的肠道健康调节作用均较DOP弱，但F50S较其它分级组分的作用更为明显。以上研究结果表明，铁皮石斛多糖及其分级组分对小鼠免疫调节和肠道健康均有一定积极作用，不仅能增加免疫器官的质量，还能促进IFN-γ、TNF-α、IL-6等细胞因子的分泌，调节Th1与Th2型之间的平衡从而调节机体免疫，并在肠道健康方面发挥着重要作用。[1]张启香，方炎明.铁皮石斛组织培养及试管苗营养器官和原球茎的结构观察[J].西北植物学报，2005，25（9）：1761-1765.