21日龄CD163基因编辑猪血液生理生化及免疫指标的测定和分析

张立苹,吴常宝,牟玉莲,周伟良,华再东,华文君,李 奎*,毕延震*

(1.湖北省农业科学院 畜牧兽医研究所/动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室,湖北 武汉 430064;2.内蒙古大学 生命科学学院,内蒙古 呼和浩特 010000;3.中国农业科学院 北京畜牧兽医研究所,北京 100193;4.天津市宁河原种猪场,天津 301504)

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS，即蓝耳病)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV)引起的以妊娠母猪早产、晚期流产、死胎、弱胎和木乃伊胎等繁殖障碍及仔猪和生长猪的呼吸系统疾病为主要特征的一种高致死性的传染病[1-2],由于其传染快、致死率高,每年都给生猪养殖带来了巨大的损失。研究证明猪蓝耳病毒是通过单核细胞膜或巨嗜细胞膜的CD163受体感染猪,突变CD163基因能够有效地阻止蓝耳病毒感染单核细胞或巨嗜细胞,使猪具有天然抵御蓝耳病毒的能力[3-5]。

血液生理生化指标是反映动物健康状况的重要指标,尤其生化指标可以作为遗传标记来预测动物的生产性能,特别是酶活性对确定猪种质特性、进行选种选配具有更重要的意义[6]。本文以CRISPR/Cas9技术联合体细胞克隆技术制备的CD163基因编辑猪(由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所制备)为研究对象,检测21日龄CD163基因编辑猪前腔静脉血液的生理生化指标、免疫球蛋白及补体蛋白等含量,为选育具有天然抵御蓝耳病毒的新品种猪提供基础的生物学数据。

1 实验材料

1.1 试验动物

随机选取21日龄健康断奶仔猪25头,体重6～7 kg,包括CD163基因突变猪纯合子10头、杂合子10头,阴性猪5头,饲养于天津宁河种猪场。

1.2 主要试剂

猪免疫球蛋白A(IgA)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒(19041202M)、猪免疫球蛋白E(IgE)ELISA试剂盒(19041203M)、猪免疫球蛋白G(IgG)ELISA试剂盒(19041201M)、猪免疫球蛋白M(IgM)ELISA试剂盒(19041204M)、猪补体蛋白3(C3)ELISA试剂盒(19041205M)、猪补体蛋白4(C4)ELISA试剂盒(19041206M),均购自江苏酶标生物科技有限公司。

1.3 主要仪器

全自动生化分析仪(型号为Pointcare M3),购自天津微纳芯科技有限公司;高速冷冻离心机(型号为Sigma 3-18k),购自德国Sigma公司;多功能酶标仪(型号为PE Victor X ),购自美国PerkinElmer Victor X 公司。

2 实验方法

2.1 前腔静脉血液的采集

在血液采集前禁食24 h,清晨空腹前腔静脉采血,由1～2位饲养员将断奶仔猪抓起,采取正面仰卧保定,将两前肢稍向两侧扳开竖起,充分暴露采血部位即两前肢与气管交汇处(第一对肋骨与胸骨柄结合处)。在术部用碘酊棉球消毒后,采血人员手持带有9号枕头的一次性10 mL注射器,朝采血部位垂直进针,边进针边抽注射器活塞,使针管内真空,采集所需血液。用采集血液中的约3 mL制备血清，用于免疫指标及补体蛋白指标的检测；将另外的3 mL血液移置于提前准备好的无菌EDTA抗凝管中，用于生理生化指标的检测。

2.2 血清的制备

将采集的全血于室温条件下自然凝固30 min,取凝固后的上清液至1.5 mL离心管中,以2000～3000 r/min的转速离心20 min,仔细收集上清液,要确保收集的上清中无沉淀,如出现沉淀则再次离心,重新收集。

2.3 血液生理指标的测定

取20 μL用EDTA抗凝的全血与500 mL稀释液混匀,用全自动生化分析仪进行检测,检测白细胞计数(WBC)、淋巴细胞比率(LY)、中间细胞比率(MID)、粒细胞比率(GRAN)、淋巴细胞(LYM)、中间细胞(MID)、粒细胞(GRAN)、红细胞计数(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)、红细胞平均体积(MCV)、血红蛋白含量(MCH)、血红蛋白浓度(HGB)、血红蛋白浓度红细胞分布宽度SD、血红蛋白浓度红细胞分布宽度CV、血小板总数(PLT)、血小板平均体积(MPV)、血小板分布宽度(PDW)、血小板压积(PCT)和血小板大细胞比率(P-LCR)等共计20项生理指标。

2.4 血液生化指标的测定

取20 μL用EDTA抗凝的全血与500 mL稀释液混匀,用全自动生化分析仪进行检测,检测白蛋白(ALB)、总蛋白(TP)、球蛋白(GLO)、白球比(A/G)、钙(Ca)、葡萄糖(GLU)、尿素氮(BUN)、无机磷(P)、淀粉酶(AMY)、胆固醇(CHOL)、谷丙转氨酶(ALT)、总胆红素(TBIL)、碱性磷酸酶(ALP)、肌酐(CRE)、尿素氮/肌酐比(BUN/CRE)和肌酸激酶(CK)等共计16项生化指标。

2.5 血液免疫球蛋白的测定

按照相应的猪免疫球蛋白酶联免疫分析(ELISA)试剂盒说明书进行检测,检测指标为免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白E(IgE)。用酶标仪在450 nm波长下测定OD值,通过标准曲线计算样品中猪免疫球蛋白含量。

2.6 补体指标的测定

按照相应的猪补体蛋白酶联免疫分析(ELISA)试剂盒说明书进行检测,检测指标为补体蛋白3(C3)和补体蛋白4(C4)。用多功能酶标仪在450 nm波长下测定OD值,通过标准曲线计算样品中猪补体蛋白含量。

2.7 数据的统计分析

采用软件SPSS 19.0对实验数据进行统计分析,试验数据以“平均值±标准误”表示,P<0.05表示差异显著。

3 结果与分析

3.1 CD163基因编辑对21日龄断奶仔猪血液生理指标的影响

由表1可知,CD163基因编辑后,其中纯合子的淋巴细胞比率、中间细胞比率、红细胞平均体积显著低于杂合子和阴性猪(P<0.05),纯合子的粒细胞比率、粒细胞数显著高于杂合子和阴性猪(P<0.05),而杂合子的血小板总数显著高于纯合子和阴性猪(P<0.05),其余指标差异不显著(P>0.05)。

表1 21日龄CD163基因编辑猪血液生理指标检测结果

注:同行数据后附不同小写字母表示差异显著(P<0.05),附相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)。下同。

3.2 CD163基因编辑对21日龄断奶仔猪血液生化指标的影响

从表2可以看出,CD163基因编辑后,纯合子猪的葡萄糖和胆固醇含量显著高于杂合子和阴性猪的(P<0.05),其余指标差异均不显著(P>0.05)。

表2 21日龄CD163基因编辑猪血液生化指标检测结果

3.3 CD163基因编辑对21日龄断奶仔猪血液免疫球蛋白含量的影响

由表3可知,CD163基因编辑后,纯合子血液中IgG、IgA、IgE和IgM等4类免疫球蛋白的含量均显著高于杂合子和阴性猪(P<0.05)。

表3 21日龄CD163基因编辑猪免疫球蛋白ELISA检测结果

3.4 CD163基因编辑对21日龄断奶仔猪血液补体蛋白含量的影响

由表4可见,CD163基因编辑后,纯合子血液中C3和C4与杂合子和阴性猪没有显著性差异(P>0.05)。

表4 21日龄CD163基因编辑猪补体蛋白ELISA检测结果

4 讨论与结论

畜禽的生产性能是动物机体内特定生理生化过程的综合结果[7]。因此,动物血液生理生化指标不仅可以反映动物的生理和健康状况,而且可以作为体现机体代谢状况的指标,在动物生产性能及其适应性方面的研究中具有重要的参考价值[8]。同时动物血液生理生化指标也是畜禽饲养、繁殖、保护和疾病防治的重要参考指标[9],可以作为辅助手段应用于生产中分类选育及检验饲养管理是否合理[10-11]。然而,血液中各指标的变动受畜禽的性别、年龄、营养水平、生活环境、生理状态以及检测方法等很多因素的影响,但是,在正常情况下,畜禽血液生理生化指标具有相对的稳定性,这些指标的变动提示动物机体新陈代谢和生理病理的变化[12]。在本实验中,选择健康正常的21日龄CD163基因编辑猪纯合子和21日龄CD163基因编辑猪杂合子为研究对象,以健康正常的阴性猪作为对照,检测了其前腔静脉血液生理生化指标,结果显示,生理指标中变化较大的是淋巴细胞比率、中间细胞比率、红细胞平均体积,其纯合子明显低于杂合子和阴性猪，然而,其粒细胞比例要明显高于杂合子及阴性猪,产生这种情况的原因有待进一步研究,但是其余指标均无明显的变化,说明CD163基因编辑对断奶仔猪的健康状况基本上没有影响。

畜禽血液中TP由ALB与GLO构成,三者的浓度反映了机体对蛋白质的吸收、合成和分解的基本状况以及动物体对蛋白质的消化利用程度和机体自身的免疫情况[13-14]，而畜禽血液中酶及蛋白水平等生化指标是反映动物营养水平、新陈代谢能力、机体健康状况及生产性能等的重要因素,它在机体的物质代谢、能量传递、免疫调节和生长发育等方面都起着十分重要的作用[15]。白蛋白是总蛋白和球蛋白的总称,其中白蛋白是由肝脏合成并具有维持血浆正常胶体渗透压和pH值、运输脂肪酸和胆红素等作用的一类小分子蛋白质,它是反映机体健康与否的重要参考指标,也可以用它来评价动物抗逆性能的优劣,在正常范围内,球蛋白含量的高低直接反映了机体对疾病的抵抗程度[16]。CK通常存在于动物心脏、肌肉及脑等组织的细胞浆和线粒体中,是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶[17]。血糖是碳水化合物代谢的中间产物,是机体重要的能源,其含量多少可反映机体能量代谢和糖代谢状况,低水平的血糖含量是能量缺乏的标志。血清总胆固醇含量是机体脂类代谢的反映,胆固醇在体内的主要生理作用是形成胆酸、构成细胞膜、合成激素；同时甘油三酯含量的高低反映了动物机体对脂类的吸收和代谢状况[20]。本实验生化指标检测结果显示,CD163基因编辑纯合子血液中葡萄糖含量显著高于杂合子和阴性猪,但是其含量均处于行业标准正常范围之内,说明供试猪机体内葡萄糖代谢是正常的；然而,CD163编辑纯合子血液中胆固醇的含量高于杂合子和阴性猪,并且均高于行业标准,导致这种现象的原因需要进一步深入检测分析。检测结果中其余指标在三者之间无显著差异,表明CD163基因编辑对断奶仔猪机体的代谢功能无影响。

免疫球蛋白是指具有抗体活性的动物蛋白,是动物受抗原刺激后机体产生的能与抗原特异性相互作用的一类球蛋白,主要存在于动物血浆中,也见于其它体液和组织中,参与动物体液免疫调节。补体蛋白是一种血清蛋白质,存在于动物血清及组织液中,活化后具有酶活性,可介导免疫应答和炎症反应,可被抗原-抗体复合物或微生物所激活,导致病原微生物裂解或被吞噬,其中补体C3和补体C4在动物血清中的含量高于其他补体成分。本实验检测结果表明,CD163基因编辑纯合子前腔静脉血液中IgG、IgA、IgE和IgM等4类免疫球蛋白的含量均显著高于杂合子和阴性猪,说明21日龄CD163基因纯合子的免疫力要强于杂合子和阴性猪；但是血清中补体蛋白水平在三者之间无显著差异,其原因需要进一步深入研究。

本文测定的数据表明,该CD163基因编辑猪具有适应性强、抗病力强等优势,在生长发育方面有不同程度的改善和提高,部分血液生理生化指标的变化表现其在特定生态条件和饲养管理条件下的特异性,本研究结果可为该抗病猪的选育及品种开发利用等方面提供参考依据。