一株芒果蒂腐病病原菌的鉴定及中草药对其抑制作用分析

欧阳秋飞，杨建波，马 博，陆家明，骆建宇

(百色学院，广西 百色 533000)

芒果(MangiferaindicaL.)，别名杧果、檬果、庵罗果，系漆树科(Anacardiaceae)芒果属(MangiferaL.)植物的成熟果实[1]。在我国，右江河谷是4大芒果优势主产区之一，更有“中国芒果之乡”的称号。芒果采收后极不耐贮藏，易受病原菌侵染而腐烂，使得货架期短，经济损失严重。芒果蒂腐病是引起芒果采后腐烂的主要原因之一，其所致病果率可达10%～40%。已有文献报道，引起海南、广东和南宁芒果蒂腐病的病原菌主要有4种，分别是可可球二孢菌(BotryodiplodiatheobromaePat.)、多米尼加小穴壳(DothiorelladomincanPet. et Cif.)、芒果拟茎点霉(PhomopsismangiferaeAhmad.)及芒果褐色蒂腐病菌(Phomopsismangiferae)[2-7]。针对百色右江河谷芒果蒂腐病菌的种类和中草药抑菌筛选未见相关报道。因此，明确右江河谷芒果蒂腐病的主要致病菌，可为采后芒果蒂腐病的正确诊断、药剂筛选、防腐保鲜等提供理论依据，也在减少储运损失、增加经济效益等方面具有重要意义。

就目前而言，使用化学杀菌剂还是世界各地控制芒果采后病害的主要方式，但其对环境、生态、人体健康的不利影响，使得人们致力于寻找更为安全、友好、高效的新型果蔬防腐保鲜剂。中草药中的抑菌活性物质能够破坏植物病原菌的结构[8,9]，干扰病原菌的代谢[10,11]，从而能够减缓或解除植物病害的发生，利用中草药提取物制备天然防腐保鲜剂，具有可观的应用前景。已有文献报道，丁香[1]、荜茇[12]、高良姜[13]、黄芩[14]、岗松[15]和韭菜[16]等对多种果蔬炭疽病、枯萎病和蒂腐病等病原真菌具有较好抑制作用。本文针对右江河谷芒果蒂腐病菌，选取15种中草药水提取液和醇提取液进行抑菌试验，从中获得了有效的中草药种类和提取剂类别，不仅进一步扩大了抑菌活性物质的筛选范围，也为有效中草药的活性成分及结构的确定奠定了基础，同时也为右江河谷芒果蒂腐病的防控提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用菌株是从百色市水果批发市场的发病芒果上经分离纯化后获得；致病性测定所用芒果为百色市右江区种植的台农1号；大蒜、薄荷、莱菔子、白菊花、半夏、益母草、忍冬藤、罗汉果、连翘、石菖蒲、栀子、金银花、决明子、艾叶、萆薢等中草药购自百色市生物药品连锁有限公司或华润超市；试验所用培养基为PDA；所用试剂皆为分析纯。

1.2 病原菌的分离、纯化

将收集到的芒果病样在室内进行组织分离[17]，纯化培养3次后，保存于4 ℃冰箱备用。

1.3 病原菌的形态观察

将纯化后的分离菌转接到培养皿上，培养2 d后观察其菌落形态；再挑取纯化菌落做成临时玻片，在显微镜下观察其菌丝和孢子形态特征。参照魏景超[18]的真菌鉴定手册进行鉴定。

1.4 病原菌的致病性测定

根据科赫氏法则进行致病性的测定。首先选取健康、大小、成熟度一致的芒果，用自来水冲洗干净，在超净工作台中用75%酒精擦拭芒果表面进行消毒；用口径为1 cm的打孔器在芒果侧面打2个孔，取菌丝长势好的培养皿用口径为0.9 cm的打孔器打取菌块接种到芒果上；以接种空白无菌的PDA培养基为对照。将以上处理果实贮藏于光照培养箱中(28～30 ℃，湿度80%)，每天观察、记录发病情况，发病后的芒果重新分离病原菌，并与接种菌进行对比。

1.5 病原菌分子鉴定

使用EP管液氮研磨法提取病原菌基因组DNA。采用真菌通用引物ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)进行PCR扩增，反应体系为50 μL，条件为：94 ℃，3 min；94 ℃，30 s；60 ℃，20 s；72 ℃，30 s；32个循环后，72 ℃，10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，将PCR产物送至上海生工生物股份有限公司进行测序。

测序后所得序列通过Blastn进行同源性搜索，选取与病原菌同源性高的序列，用MEGA 4.0软件构建分子系统发育树，并用1000次重复的Boodstrap进行检验。

1.6 中草药提取液制备

1.6.1 水提取法 称取20 g经烘干、粉碎后的中草药粉末，在200 mL蒸馏水中常温浸泡2 h，大火煮沸，转小火熬煮30 min，用8层纱布过滤后，转至旋转蒸发仪上以85 ℃、65 r/min的条件旋转蒸发，将提取液浓缩、定容至20 mL，最后使用灭菌的细菌过滤器进行过滤除菌，密封后置于4 ℃冰箱中保存备用。

1.6.2 醇提取法 称取20 g经烘干、粉碎后的中草药粉末，加入100 mL 20%的乙醇浸泡24 h，在55 ℃的水浴锅中用时间间隔2 s、持续1 s的超声波信号发生器震荡30 min；之后加入60%乙醇浸泡24 h，在55 ℃的水浴锅中用时间间隔2 s、持续1 s的超声波信号发生器震荡30 min；用8层纱布过滤后，转至旋转蒸发仪上以85 ℃、65 r/min的条件旋转蒸发，将提取液浓缩、定容至20 mL；最后使用灭菌的细菌过滤器进行过滤除菌，密封后置于4 ℃冰箱中保存备用。

1.7 平板抑菌试验

采用生长速率法。用移液枪吸取3 mL的中草药提取原液加入47 mL的PDA培养基中，混匀，分别倒3个平板，用口径为5 mm的灭菌打孔器打取菌块，再用灭菌镊子接种到PDA平板上，每皿接一块菌块，每种提取物做3次重复；以加入3 mL无菌水或乙醇的培养基做对照。用封口胶封住皿口，于28 ℃恒温培养箱中倒置培养，每隔12 h观察拍照，使用十字交叉法测量菌落直径，每皿测3次，记录数据，取平均值。抑菌率公式如下：

菌落直径=测量菌落平均直径-打孔器口径

菌丝生长抑制率(%)=

1.8 最低抑菌浓度(MIC)测定

按照中草药提取物终浓度为0.01～0.12 g/mL的浓度梯度来配制PDA含药平板，每个浓度做3个重复。以抑菌率100%的最低浓度为该提取物的最低抑菌浓度(MIC)。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离、纯化与形态观察

通过组织分离法，从蒂部腐烂的芒果上分离得到5种不同形态的真菌菌株，根据科赫氏法则选择菌株BSD01回接到健康芒果上，2 d后能引起芒果发病。BSD01在PDA培养基上菌落圆形，生长速度快，菌丝生长旺盛，绒毛状，初为白色，后逐渐变灰直至黑色，菌落培养基由淡黄色转至墨绿色，最后变为黑褐色。通过显微镜观察发现，BSD01分生孢子无色，单胞，卵形或椭圆形(图1)。

根据真菌鉴定手册及查阅芒果蒂腐菌的相关文献，对比菌落形态、生长特点及孢子形态，可将BSD01初步鉴定为芒果蒂腐病菌。为了进一步鉴定BSD01的种类，利用PCR的方法对其进行ITS序列测定。

A. 菌落形态；B.分生孢子；C.对照接种症状；D.病原菌接种症状

2.2 病原菌ITS序列测定及系统发育树构建

BSD01的ITS基因经过PCR扩增后，得到一条500 bp左右的特异性条带(图2)；测序后，得到一条520 bp的有效序列；将获得的序列在NCBI中进行BLAST比对，发现菌株BSD01与可可球二孢菌(BotryodiplodiatheobromaePat.，异名Lasiodiplodiatheobromae)的序列相似性高达100%。基于ITS 序列分析结果，选取同源性高低不同的球二孢属菌株序列，使用MEGA 4.0软件构建系统发育树(NJ)，发育树(图3)表明，菌株 BSD01与Lasiodiplodiatheobromae(KR260801.1)聚为一簇，具有很近的遗传关系。因此，结合病原菌BSD01的形态特征，可将BSD01鉴定为可可球二孢菌(BotryodiplodiatheobromaePat.)。

2.3 中草药提取液对病原菌的抑制作用

2.3.1 抑菌率的测定 采用SPSS 17.0的Duncan多重比较对各中草药提取液的抑菌效果进行差异显著性分析，结果见表1，部分提取液的抑菌效果见图4。

图2 BSD01 ITS基因的PCR扩增电泳结果

从表1可以知道，在0.06 g/mL 的浓度下，15种中草药除了大蒜、萆薢水提取液对芒果蒂腐可可球二孢菌没有抑制作用外，其他提取液对其均表现出一定的抑菌效果；同时还能看出，中草药醇提取液的抑菌活性总体高于水提取液。在水提取液中，莱菔子的抑菌效果最好，抑菌率可达100%，其次为连翘和艾叶，抑菌率分别为46.7%和46.6%，其余中草药水提取液的抑菌效果则不明显。在醇提取液中，益母草也能达到100%的抑菌效果，而石菖蒲、莱菔子、大蒜、艾叶和决明子对芒果蒂腐可可球二孢菌也有较好的抑菌活性，抑菌率分别为94.6%、73.2%、58.9%、54.5%和52.3%。

图3 BSD01 ITS序列基因系统发育树

中草药名称抑菌率水提取液醇提取液中草药名称抑菌率水提取液醇提取液半夏6.8 OP5.4 P连翘46. 7 F46.0 F薄荷18.6 KL26.8 H石菖蒲17.3 L94.6 B大蒜0 Q58.9 D栀子10.9 V14.2 M菊花17.0 L21.4 J金银花13.6 M8.8 NO莱菔子100 A73.2 C萆薢0.0 Q21.0 JK益母草34.7 G100 A艾叶46.6 F54.5 E忍冬藤18.7 KL28.4 H决明子24.1 I52.3 E罗汉果22.7 IL27.0 H

注：以上数据在28 ℃培养36 h后测得；同列数字后不同字母表示差异显著(P<0.05)。

a～d分别为CK、莱菔子、连翘、艾叶水提取物；A～D分别为CK、益母草、石菖蒲、莱菔子醇提取物。

2.3.2 最低抑菌浓度(MIC)的测定 根据抑菌率测定的结果，筛选出对芒果蒂腐可可球二孢菌有较好抑制效果的中草药提取液，对其进行最低抑菌浓度(MIC)的测定，结果见表2。

由表2可知，芒果蒂腐可可球二孢菌对莱菔子水提取液最为敏感，在浓度为0.01 g/mL时，就已经无菌丝生长，其最低抑菌浓度<0.01 g/mL；其次为益母草醇提取液，MIC为0.02 g/mL；连翘、艾叶水提取液及石菖蒲、决明子醇提取液的MIC相同，为0.11 g/mL；莱菔子、艾叶醇提取液的MIC同为0.09 g/mL；大蒜醇提取液的MIC为0.10 g/mL。最低抑菌浓度测定的结果与表1抑菌率测定的结果基本一致，莱菔子水提取液与益母草醇提取液对芒果蒂腐可可球二孢菌有显著的抑制活性，有进一步研究的潜力。

表2 有效中草药提取液对芒果蒂腐可可球二孢菌的最低抑菌浓度(MIC)

注：“+”表示菌丝生长，“-”表示无菌丝生长。

3 讨论与结论

通过致病性测定、形态学观察和分子生物学鉴定，将引起百色右江河谷芒果蒂腐病的BSD01确定为可可球二孢菌(BotryodiplodiatheobromaePat.)，这是针对右江河谷芒果蒂腐病菌的首次报道，其它能引起芒果蒂腐病的病原菌种类仍待后续进一步鉴定。

王萌等[19]检测了30个海南芒果蒂腐可可球二孢菌对10种杀菌剂的抗药性，发现海南芒果蒂腐可可球二孢菌已对多菌灵、甲基硫菌灵、醚菌酯、嘧菌酯、吡唑醚菌酯、苯醚甲环唑和咪鲜胺锰盐等7种杀菌剂产生了抗药性，还发现可可球二孢菌具有丰富的遗传多样性，该特性与病原菌抗药性之间存在明显的相关性。因此，基于中草药天然防腐保鲜剂具有广谱、高效、不产生抗性、不污染环境等优点，本研究利用15种中草药提取液对芒果蒂腐可可球二孢菌进行抑菌活性筛选，确定了9种中草药提取液对芒果蒂腐可可球二孢菌具有较好的抑菌效果，其中莱菔子水提取液和益母草醇提取液的抑菌效果最为显著，在浓度为0.06 g/mL的条件下，抑菌率皆为100%，莱菔子水提取液的MIC值<0.01 g/mL，益母草醇提取液的MIC值为0.02 g/mL；石菖蒲、莱菔子醇提取液对芒果蒂腐可可球二孢菌也有较好的抑菌活性，抑菌率分别为94.6%和73.2%，MIC值分别为0.11 g/mL和0.09 g/mL。

运用不同提取方法，同种中草药对芒果蒂腐可可球二孢菌的抑制作用有较大差异。如益母草、石菖蒲的醇提取液的抑菌效果远远大于水提取液；大蒜、萆薢的水提取液没有抑菌作用，而醇提取液却有不同程度的抑菌效果；莱菔子水提取液和醇提取液皆具有较好的抑菌作用，原因可能是每种中草药的有效抑菌活性成分不同，它们在不同溶剂中有效析出的量也不同；中草药的成分复杂，不同组分的提取液，抑菌作用与机理也不尽相同[20-21]。有研究表明，从益母草种子中分离纯化的抗菌小蛋白LJAMP1和LJAMP2对多种植物病原真菌具有很强的抑菌活性。李先碧等[22]利用根癌农杆菌介导法将这两种抗菌蛋白基因转入番茄并超量表达，发现转基因番茄对黄萎病、早疫病和青枯病均有显著抗性。郭绍辉等[23]将LJAMP2蛋白基因导入毕赤酵母菌，经表达、发酵、纯化后，发现该蛋白对黑曲霉(Aspergillusniger)、玉米小斑病菌(Bipolarismaydis)、镰刀菌(Fusariumgraminearum)等真菌表现出抑制活性。莱菔子的有效抗菌成分为莱菔子素，在体外有强烈的抗菌活性，易溶于水、甲醇、乙醇、氯仿和乙醚，在250 mg/mL浓度时，就能抑制某些病原细菌和真菌的生长。胡新文等[24]从萝卜中提取的抗真菌蛋白(Rs-AFP 1, Rs-AFP 2)，对镰刀菌、疫霉菌(Phytophthora)、芭蕉炭疽菌(Colletotrichummusae)和稻瘟菌(Pyriculariaoryzae)等多种真菌都有抑制作用。杨萌[25]报道了莱菔子多糖SRP对大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草杆菌(Bacillussubtilis)、青霉(Penicillium)和黑曲霉都有一定的抑制效果，且利用莱菔子多糖SRP涂膜处理苹果和樱桃，能起到较好的防腐保鲜效果。由此可见，益母草和莱菔子提取液具有广谱的抗真菌活性，在抗菌药物的开发和果蔬防腐保鲜方面值得进一步深入研究。本研究所得提取液仅为中草药粗提物，且只进行了离体抑菌实验，因此有效提取液对芒果的活体试验、抑菌活性成分、抑菌作用机理、化学仿生合成等方面均有待进一步研究和探讨。