QuEchERS-HPLC-MS/MS 法测定槟榔中42种农药残留①

龚 敏 孙慧洁 张春冬

(海南省现代农业检验检测预警防控中心 海南海口570100)

槟榔果实（Areca seed），又名宾门、仁频、榔玉等，是棕榈科常绿植物槟榔的成熟种子。由于槟榔含有独特的植物化学成分，有抗抑郁、降血压、抗炎、抗氧化、抗血栓等药理作用［1]，临床上对治疗疳症、积滞、痢疾、便秘、小儿感冒等儿科疾病均有疗效［2-4]。槟榔为海南农民脱贫致富的主要经济作物之一［5]。近几年来槟榔炭疽病、果腐病、煤烟病、黄化病等［6-7]病虫害严重影响了海南槟榔的产量。目前较有效的槟榔病虫害防治方法之一是喷洒农药。但农药的使用在防治槟榔病虫害的同时也会影响槟榔的质量安全，槟榔农药残留的检测是保障槟榔质量安全的手段之一。

据文献记载，目前农药残留检测常用的方法有：气相色谱法（GC）［8-9]、气质联用法（GCMS）［10-11]、液 相 色 谱 法（LC）［12]和 液 质 联 用 法（LC-MS/MS）［13-14]。农药残留质谱测定通常与色谱分离技术联用，以同时提供保留时间、质荷比和离子丰度信息，是目前农药多残留分析方法的主导技术和未来发展趋势，该技术在农药残留检测中得到了广泛的开发与应用。液相色谱—质谱法（LC-MS）是液相色谱和质谱的有机结合，高分离性能的液相色谱可用于检测极性强和热稳定性差的农药成分［15]，质谱具备高选择性、高灵敏度的特点，因此能对复杂基质中的农药残留进行检测［16]。

串联质谱多反应检测模式（MRM）的HPLC-MS/MS［17-18]因具有更好的灵敏度和准确性而被广泛地应用于农药多残留检测技术中。本研究基于传统的QuEChERS 法并进行改进优化，结合串联质谱多反应检测模式（MRM）的HPLC-MS/MS 法，建立了槟榔中42种农药多残留的定性、定量检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

日本岛津公司生产的Nexerax2 型超高效液相色谱仪；美国AB 公司生产的AB SCIEX QTRAP 550 三重四级杆质谱仪；杭州佑宁公司生产的MIX-2500混合仪；Thermo 科技公司的高速冷冻离心机；梅特勒托利多公司的ME-203/02电子天平；德国默克公司的水纯化系统。

德国MERCK 公司的乙腈，甲醇，甲酸，乙酸，乙酸铵（色谱纯级别）；上海安谱的尼龙过滤膜（0.22 μm）。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液的配置

所用的吡虫啉、三唑磷等42 种农药标准品均来自农业农村部环境保护科研监测所，浓度均为100 μg/mL。准确吸取各标准溶液0.1 mL，用乙腈定容至100 mL，得到浓度为0.1μg/mL 的混合标准溶液。检测时，再用槟榔空白基质溶液分别配制成2、5、10、20、50 ng/mL 的基质混合标准工作溶液。

1.2.2 样品前处理

将新鲜槟榔鲜果样品于-18℃以下冷冻至脆，高速粉碎机破碎，剪碎其纤维；准确称取5 g（精确至0.01 g）至50 mL 具塞离心管中，加入一定量的超纯水浸润水化30 min，再加入20 mL 1%乙酸-乙腈，涡旋震荡5 min；加入6 g MgSO4，1.5 g 乙酸钠，涡旋混合1 min，8000 r/min 离心10 min，取0.5 mL 上清液与0.5 mL 超纯水混匀过滤膜（0.22 μm）待测。

1.2.3 色谱条件

色谱柱：phenomenex Kinetex 50 mm×3.0 mm，2.6 μm，填料为C18；柱温：40℃；流速：0.4 mL/min；进样量：2 μL；流动相：A，0.1%甲酸-0.005 mol/L乙酸铵水；B，乙腈。洗脱条件见表1

表1 液相色谱洗脱条件

1.2.4 质谱条件优化

离子源：电喷雾离子源（ESI）；离子源温度350℃；离子源电压5500V；正离子扫描；数据采集运用多反应检测模式（MRM）；CUR气帘气：30 psi，GS1喷雾气：50 psi；GS2（辅助加热器）：55 psi。

2 结果与分析

2.1 样品处理方法的优化

2.1.1 提取溶剂的选择

提取溶剂一般根据待测样品和农药成分的特性进行选择，农药残留分析常用的提取溶剂有甲醇、丙酮、乙酸乙酯和乙腈［19]。本研究对甲醇、丙酮、乙酸乙酯和乙腈4种有机溶剂进行了实验考察。结果表明：乙腈作为一种极性有机溶剂，能够产生很好的相分离作用。本实验的样品为槟榔鲜果，其含有大量的纤维，水分较少，为使样品在试剂中分布均匀从而达到充分提取的目的，加入提取溶剂前先加入一定量的水进行浸润水化，再在乙腈中加入1%的乙酸可使样品提取液处于平衡缓冲状态，从而提高并稳定回收率。因此，本实验选择1% 的乙酸乙腈溶液作为提取溶剂。

2.1.2 净化条件的选择本试验分别考察了QuEchERS 的前处理方法中加PSA和不加PSA 的净化效果。结果表明，使用PSA 对样品进行净化时，PSA 在吸附极性杂质的同时也会对某些农药成分有不同程度的吸附；不加PSA 时，虽然一定程度上存在杂质干扰和基质效应，但目标农药成分也可完全分离，回收率也能满足实验需求。因此本研究基于QuEchERS 前处理方法进行改进，省去PSA过程，直接提取分层后的上清液，与超纯水混匀后过膜上机检测。

2.2 仪器条件的优化

2.2.1 色谱条件优化

本研究分别考察了流动相A（水、0.1%甲酸水溶液、5mmol/L 乙酸铵、0.1%甲酸水溶液和5 mmol/L 乙酸铵混合水溶液）以及流动相B（乙腈、甲醇溶液）对峰形、响应值等影响。结果表明，以流动相A（0.1%甲酸水溶液和5 mmol/L乙酸铵混合水溶液）及流动相B（乙腈溶液）作为流动相时峰形更好，响应值更高。42种农药的MRM总离子流色谱图详见图1。

2.2.2 质谱条件的确定

ESI 正离子模式下，采用针泵流动注射进样方式对42 种农药的混合标准品进行Q1 SCAN，先确定待测物的分子离子质荷比，找到目标化合物母离子；再通过Product Ion Scan，确定子离子的质荷比。通过选出的母、子离子，组建MRM离子对，对化合参数CE、DP 进行优化，同时对离子源参数（气帘气、离子化电压、温度、喷雾气等）进行优化，建立MRM 模式下42 种农药的扫描方法，详见表2。

表2 MRM模式下42种农药的扫描参数

续表2 MRM模式下42种农药的扫描参数

续表2 MRM模式下42种农药的扫描参数

2.3 方法评价

2.3.1 线性范围和检出限

分别配制了2、5、10、20、50 ng/mL 的42 种系列基质混合标准工作溶液，在优化好的仪器工作条件下依次进样，分别以峰面积Y为纵坐标，浓度值X为横坐标，绘制标准曲线。由表3 可知，42种农药的质量浓度在2～50 ng/mL，浓度与峰面积呈良好的线性关系，相关系数（r）均高于0.999，符合《实验室质量控制规范》（GB/T 27404-2008）中对校准曲线相关系数不低于0.99的要求。

通过检测槟榔空白基质中添加已知低浓度农药参数的样品和槟榔空白基质样品的测量信号进行比较，考察检出限，检出限为信噪比（S/N）的3 倍，通过检测计算，本方法农药多残留的检出限在0.1～3.2 μg/kg，详见表3。

2.3.2 精密度和回收率试验

本实验用筛选好的槟榔样品空白基质进行加标回收与精密度试验，添加低、中、高3 个水平（10、50、100 μg/kg）进行LC-MS/MS 分析，计算平均回收率和精密度，每个添加浓度做6个平行试验，用于考察本方法的回收率和精密度，结果见表3。

由表3 可知，3 个添加水平下，42 种农药的平均回收率范围为75.9%～105.6%，相对标准偏差小于13.4%，表明该方法有较高的精密度和准确度，满足实验室检测中对灵敏度、精准度、准确度及重复性、稳定性的要求。

3 结论

通过调研，选取槟榔种植过程中使用较为普遍的农药，建立了槟榔中42 种农药多残留的检测方法，该方法采用改进优化的QuEChERS 前处理方法，并利用液相色谱－串联质谱进行分析测定。结果表明：该QuEChERS-液相色谱－串联质谱法操作简便、高效、准确且重现性好，具有较好的灵敏度、准确度和精密度，能满足槟榔鲜果中农药残留的检测要求，适用于食用槟榔鲜果中农药残留含量测定。