高效液相色谱-荧光检测法测定饲料中乙氧酰胺苯甲酯含量

刘发全 明文庆 宋亚伟 丁在亮 吴昊

摘要 [目的]建立高效液相色谱-荧光检测法测定饲料中乙氧酰胺苯甲酯含量。[方法]饲料中乙氧酰胺苯甲酯经甲醇超声提取，采用ZORBAX Eclipse XDB-C18（ 4.6 mm×150 mm，5 μm）色谱柱分离，以乙腈-水溶液（25∶75）为流动相，流速为1.0 mL/min，荧光激发波长为306 nm，发射波长为350 nm，进样量20 μL。采用荧光检测器（FLD）检测，外标法定量。[结果]乙氧酰胺苯甲酯分离度良好，在0.192～9.661 μg/mL与峰面积呈良好的线性关系，平均回收率在93.5%（n=6），RSD为0.22%，定量限为2.0 mg/kg，检测限为1.0 mg/kg。[结论]该方法灵敏高、重复性好、操作简便，适用于饲料中乙氧酰胺苯甲酯的含量检测。

关键词 饲料;高效液相色谱-荧光检测法;乙氧酰胺苯甲酯;含量测定

中图分类号 S 816.17文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）23-0222-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.23.064

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Determination of Ethopabate Content in Feed by High Performance Liquid Chromatography fluorescence Detection

LIU Fa quan，MING Wen qing，SONG Ya wei et al

（Anhui Veterinary Drug and Feed Inspection Institute，Hefei，Anhui 230091）

Abstract [Objective]The method was established to determine the content of ethopabate by high performance liquid chromatography fluorescence detection.[Method]The methanol was used to extract ethopabate from feed.The samples were separated by ZORBAX Eclipse XDB C18 （ 4.6 mm×150 mm，5 μm），using acetonitrile aqueous solution（25∶75） as mobile phases with flow rate 1.0 mL/min， detected by fluorescence exciting wavelength of 306 nm ，by emission wavelength of 350 nm， injected with 20 μL volume. The samples were detected by fluorescence detector （FLD） ， detected by external standard method.[Result]The ethopabate had good resolution，and had a good linear relationship with the peak area from 0.192 to 9.661 μg/mL. The average recovery was 93.5%（n=6），RSD was 0.22%， the quantitative limit was 2.0 mg/kg，the detection limit was 1.0 mg/kg.[Conclusion]The method is sensitive， reproducible and easy to operate， and is suitable for detecting the content of ethopabate in feed.

Key words Feed;High performance liquid chromatography fluorescence detection method;Ethopabate;Content determination

乙氧酰胺苯甲酯（ethopabate），又名衣索巴，俗名球虫酯，添加在饲料中用于预防和治疗球虫病的药物，通过阻断四氢叶酸的合成阻止裂殖体的正常发育而发挥作用，对巨型、布氏艾美尔球虫以及其他小肠球虫具有较好的抗虫活性[1]，《饲料药物添加剂使用规范》（农业部168号公告）将乙氧酰胺苯甲酯列为可在饲料中添加使用的抗球蟲药物添加剂，通常与尼卡巴嗪、盐酸氨丙啉、磺胺喹噁啉合用增强抗球虫效果，并规定蛋鸡在产蛋期禁用，休药期为3 d。《动物性食品中兽药最高残留限量》（农业部235号公告）规定乙氧酰胺苯甲酯在禽组织中的最高残留限量分别为肌肉500 μg/kg、肝和肾1 500 μg/kg，在鸡体内不发生代谢，以药物原型排出。

目前，乙氧酰胺苯甲酯检测方法有紫外分光光度法[2]、薄层层析法[3]、电化学传感器法[4]、高效液相色谱-质谱联用法[5]、高效液相色谱法[6]等。乙氧酰胺苯甲酯原料与制剂质量标准收载于《中国兽药典》2015年版（一部）[7]，采用高效液相色谱紫外法测定含量，动物源食品中乙氧酰胺苯甲酯残留采用高效液相色谱紫外法[8]，目前尚未建立饲料中乙氧酰胺苯甲酯含量检测方法，为了准确测定含量，笔者参考相关文献报道，研究高效液相色谱-荧光法测定饲料中乙氧酰胺苯甲酯含量，以期为建立饲料中乙氧酰胺苯甲酯检测方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1

主要仪器。Agilent1260高效液相色谱仪，配荧光检测器（FLD）、四元泵、自动进样器和柱温箱，美国安捷伦公司;赛多利斯CPA225D十万分之一电子天平;KS-500EI超声波清洗机，宁波海曙科生超声设备有限公司;GT10-1型高速台式离心机，北京时代北利离心机有限公司。

1.1.2

主要试剂。乙氧酰胺苯甲酯对照品（批号：H0010910，含量100.0%）购自中国兽医药品监察所;鸡配合饲料、鸡浓缩饲料、鸡复合预混合饲料;乙腈、甲醇均为色谱纯，美国FISHER Chemical公司;水，水质符合实验室一级用水的规定。

1.2 方法

1.2.1

对照品储备液和对照品工作液的配制。精确称取100.17 mg乙氧酰胺苯甲酯对照品于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，制成对照品储备溶液;分别精密量取0.20、0.50、1.00、2.00、10.00 mL对照品储备液置于100 mL容量瓶，用甲醇稀释、定容，制成浓度为0.20、0.50、1.00、2.00、10.00 μg/mL的对照品工作液。

1.2.2

供试品溶液的制备。选取有代表性的饲料样品约500 g，四分法缩减至100 g，磨碎，全部通过0.42 mm孔径分析筛，充分混匀，精确称取饲料（鸡配合饲料2 g、鸡浓缩饲料0.4 g、鸡复合预混合饲料0.1 g），置于50 mL离心管中，准确加入25 mL甲醇，振摇混匀，超声提取30 min后，以8 000 r/min离心10 min，取离心上清液用0.45 μm尼龙滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

1.2.3

色谱分析条件。色谱柱：Agilent公司ZORBAX Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相：乙腈-水溶液（25∶75）;流速为1.0 mL/min;荧光激发波长（Ex）306 nm，发射波长（Ea）350 nm;柱温：室温;进样量20 μL。

1.2.4 方法学考察。

1.2.4.1

系统适用性试验。分别吸取对照品溶液及供试品溶液各20 μL，在“1.2.3”色谱条件下，注入液相色谱仪进行测定，记录色谱图，考察系统适应性。

1.2.4.2 线性关系的考察。自动进样器吸取“1.2.1”工作液20 μL注入HPLC，记录色谱图，以进样浓度X（μg/mL）为横坐标、峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，计算线性回归方程。

1.2.4.3 精密度试验。自动进样器精密量取浓度为1.00 μg/mL的对照品工作液20 μL，按“1.2.3”色谱条件连续进样6次，测定对照品工作液中乙氧酰胺苯甲酯峰面积，计算RSD。

1.2.4.4

稳定性试验。取同一供试品溶液，在室温下放置0、1、2、6、12、24 h后，按“1.2.3”色谱条件，注入液相色谱仪进行测定，进样量20 μL，测定峰面积积分值，计算RSD。

1.2.4.5 重复性试验。取同一批号的样品，按“1.2.2”方法制备供试品溶液6份，按“1.2.3”色谱分析条件，进样量为20 μL，测定样品中乙氧酰胺苯甲酯的峰面积，计算RSD。

1.2.4.6

加样回收率试验。精密称取20 mg乙氧酰胺苯甲酯原料，逐级稀释到2.5 kg饲料中，按“1.2.2”方法制备供试品溶液，再按“1.2.3”色谱条件测定，进样量为20 μL，测定峰面积和样品中乙氧酰胺苯甲酯的含量，并计算平均回收率和RSD。

1.2.4.7

检测限与定量限。采用空白饲料，乙氧酰胺苯甲酯添加量逐渐降低，样品经前处理和液相色谱分析后得到的添加回收率，实际测定得到的回收率和精密度能满足方法回收率（80%～120%）和精密度（RSD≤10%）要求的最低浓度作为方法检测限。

1.2.5

空白样品的测定。取不含乙氧酰胺苯甲酯的饲料，按“1.2.2”方法制备供试品溶液，再按“1.2.3”色谱条件测定。

1.2.6

样品测定。分别称取肉鸡配合饲料2 g、鸡浓缩饲料0.4 g、产蛋鸡预混料0.1 g各3份样品，按“1.2.2”方法制备样品，按“1.2.3”色谱条件注入HPLC，通过乙氧酰胺苯甲酯保留时间进行定性，测定峰面积，外标法，通过标准曲线计算样品的含量。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1

系统适用性试验。图1表明，在“1.2.3”色谱条件下，乙氧酰胺苯甲酯保留时间为12.1 min左右，对照品溶液色谱主峰保留时间与供试品保留时间一致，分离度大于1.5，理论塔板数大于6 000。

2.1.2 线性关系的考察。按“1.2.4.2”方法操作，以进样浓度X（μg/mL）为横坐标、峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，得出乙氧酰胺苯甲酯的线性回归方程为Y=134.076 X-4.613（r=0.999 97），表明乙氧酰胺苯甲酯在0.192～9.661 μg/mL与峰面积呈良好的线性关系。

2.1.3 精密度试验。按“1.2.4.3”方法操作，计算得出乙氧酰胺苯甲酯的峰面积RSD为0.65%（n=6），保留时间的RSD均小于1%，表明分析方法符合精密度的要求。

2.1.4 稳定性试验。按“1.2.4.4”方法操作，计算得出试样中乙氧酰胺苯甲酯的峰面积RSD为0.51%（n=6），表明供试品溶液在室温下放置24 h穩定。

2.1.5 重复性试验。按“1.2.4.5”方法操作，测得样品中乙氧酰胺苯甲酯的峰面积RSD为0.65%（n=6），保留时间的RSD小于1%，表明此方法重复性良好。

2.1.6 加样回收率试验。按“1.2.4.6”方法操作，测得样品中乙氧酰胺苯甲酯的含量、平均回收率和RSD，结果见表1，平均回收率为93.5%，RSD为0.22%，表明回收率较好，该方法符合要求。

2.1.7 检测限与定量限。按“1.2.4.7”方法操作，结果表明1.0 mg/kg是能达到方法回收率和精密度要求的最低浓度。根据10个空白样品的3倍平均信噪比对应的乙氧酰胺苯甲酯含量进行添加回收试验，结果表明样品中1.0 mg/kg添加浓度的回收率虽能达到回收率要求，但精密度高于方法精密度要求，所以该方法检测限为1.0 mg/kg，定量限为2.0 mg/kg。

2.2 空白样品的测定 按“1.2.5”方法操作，结果见图2，试验表明供试品基质对待测物乙氧酰胺苯甲酯没有干扰。

2.3 样品测定

按“1.2.5”方法操作，测得肉鸡配合饲料、鸡浓缩饲料、产蛋鸡预混料中乙氧酰胺苯甲酯平均含量分别为7.87、38.10、192.70 mg/kg。

3 讨论

3.1 样品的处理方法

该试验比较了采用超声波与振荡提取方法，选择不同比例甲醇、乙腈水溶液提取饲料中乙氧酰胺苯甲酯的效率进行比较，发现采用甲醇溶液超声波提取方法回收率最高，饲料成分复杂，提取液杂质较多，目标物不易分离。有文献报道[6，9]，采用固相萃取柱对试液进行净化，考虑到乙氧酰胺苯甲酯在饲料添加量在8 mg/kg左右，用固相萃取柱净化回收率变化不大，因此采用甲醇超声波提取离心后直接上机检测，方法能够减少杂质干扰，降低成本，回收率稳定。

3.2 荧光检测条件的确定

目前，国内外文献报道液相色谱法测定乙氧酰胺苯甲酯的方法中[10]，采用270 nm紫外波长测定，因鸡配合饲料中乙氧酰胺苯甲酯含量较低，试验中发现检测灵敏度低，杂质干扰比较严重，不能满足检测。该方法用荧光检测器进行检测，将仪器激发波长设定为200 nm，发射波长扫描范围设定在210～800 nm，发现发射波长在350 nm处有最大吸收，将350 nm波长作为发射波长固定下来;再做激发波长扫描，发现激发波长在306 nm处有最大吸收。因此确定荧光检测条件为激发波长306 nm、发射波长350 mm，相对于紫外检测波长提高了灵敏度2～3个数量级，提高特异性，同时减少了杂质干扰。

3.3 配伍药物干扰因素

盐酸氨丙啉、磺胺喹噁啉和尼卡巴嗪是与乙氧酰胺苯甲酯配伍使用的3种抗球虫药物[11]，分别取上述标准品约10 mg，用乙腈溶解后，上机检测，结果显示在该色谱条件下均未检测出色谱峰，对乙氧酰胺苯甲酯检测没有干扰，表明该方法具有很强的专属性。

4 结论

该研究建立了高效液相色谱-荧光检测法测定饲料中乙氧酰胺苯甲酯含量的方法，通过试验，方法灵敏高、专属性强、重复性好、操作简便，适用于检测饲料中乙氧酰胺苯甲酯的含量。

参考文献

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