超声辅助提取忍冬叶绿原酸工艺的优化

贾 莲，吕琳琳，赵 臻，孙小迷

(鞍山师范学院 化学与生命科学学院,辽宁 鞍山 114007)

忍冬(LonicerajaponicaThunb.)是我国传统中药材金银花的基源植物，具有解热消炎、凉散风热、利胆保肝等功效，主要有效成分为酚酸类和黄酮类等物质[1-2].绿原酸(chlorogenic acid)属于酚酸类，是金银花的主要活性成分，具有显著的抗氧化、抗菌、抗病毒等药理作用，应用广泛[3-5].

《本草纲目》曰：“忍冬，茎叶及花，功用皆同”，忍冬叶的有效成分与花基本相似，部分成分(如绿原酸和木犀草苷)含量甚至高于花蕾[6-8].但目前国内外针对忍冬干燥花蕾的研究较为详尽，对忍冬叶、忍冬根、忍冬果实研究较少.忍冬叶产量极高，作为生产金银花的副产品，长期以来都被作为非药用部位弃去而未得到利用.若忍冬叶含有与花蕾相近的化学成分，发挥相同或近似相同的功效，并且能够广泛应用，将对忍冬未来发展起到不可估量的作用.绿原酸是《中国药典》2015版中规定的金银花特征化合物，因此本研究以绿原酸为指标，考察其在忍冬叶中的最佳提取方法，采用超声波辅助法结合正交试验并进行工艺优化，为进一步加强忍冬叶资源的开发利用、扩大忍冬的药用部位提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

忍冬叶采集于鞍山师范学院校园内.

绿原酸标准品(中国食品药品检定研究院)，甲醇、磷酸为色谱纯(国药集团化学试剂有限公司)，乙醇为分析纯.

1525-2996液相色谱仪(美国Waters公司)，KQ5200B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司).

1.2 试验方法

1.2.1 样品处理 忍冬叶洗净沥干，60 ℃烘干至恒重，粉碎后过0.45 mm筛，备用.精密取0.5 g样品粉末，置于棕色容量瓶中，采取不同料液比、乙醇浓度、超声时间，在水浴60 ℃的条件下进行超声波辅助提取，抽滤后保留滤液，将残渣以相同方式进行二次提取，合并两次提取液.

1.2.2 液相色谱条件 色谱柱：ODS-2 Kromasil C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：0.3%磷酸水溶液-甲醇(85∶15(V∶V))；流速：1.0 mL/min；柱温：室温；检测波长：327 nm；进样量：10 μL.

1.2.3 绿原酸标准曲线的制作 精密称取绿原酸标准品10 mg，置10 mL棕色容量瓶中，加入甲醇制成1 mg/mL的母液.吸取配制好的绿原酸母液0.05,0.10,0.20,0.40,0.80 mL于瓶中，再分别加入甲醇9.95,9.90,9.80,9.60,9.20 mL，配制成浓度为5,10,20,40,80 μg/mL的溶液.根据上述色谱条件检测，记录峰面积，以绿原酸的质量浓度作为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，线性回归方程为：

y=357 049x-94 331，r=0.996 4.

1.2.4 单因素试验 参照郭华等[9]提取方法，选取乙醇浓度、料液比、提取时间3个因素进行单因素实验：

(1)选取乙醇浓度50%、60%、70%、80%、90%，固定料液比 1∶20，提取时间 40 min；

(2)选取料液比 1∶5,1∶10,1∶15,1∶20,1∶25，固定乙醇浓度 60%，提取时间 40 min;

(3)选取提取时间20,30,40,50,60 min，固定乙醇浓度 60%，料液比 1∶20，按照 1.2.1方法提取忍冬叶中绿原酸，筛选较优的单因素范围.

1.2.5 正交试验 在单因素试验的基础上，选用L9(34)正交试验设计，对提取条件进行优化，因素与水平设计见表 1.

表1 正交因素水平表

1.2.6 绿原酸得率的计算 本实验计算绿原酸得率是采用杨彬等[10]在《金银花绿原酸和木犀草苷的提取》一文中的公式：

其中m：根据标准曲线计算所得绿原酸的质量(μg)；V：提取液体积(mL)；m1：忍冬叶质量(g).

1.2.7 数据分析 采用Excel2007、正交设计助手ⅡV3.1软件进行数据统计，根据数据制作出表格及变化曲线图.

2 结果与分析

图1 乙醇浓度对绿原酸得率的影响

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 乙醇浓度对绿原酸得率的影响 由图1可知，绿原酸的得率随乙醇浓度的逐渐增加而上升，在乙醇浓度达到60%时，得率最高；当乙醇浓度超过60%时，绿原酸得率减小.

2.1.2 料液比对绿原酸得率的影响 由图2可知，当料液比小于1∶20时，绿原酸得率都随料液比的增加而提高，这是因为料液比越大，细胞内部的绿原酸物质向外扩散也越多.而当料液比大于1∶20时，由于忍冬叶中的绿原酸是一定的，故绿原酸溶解量减小.所以采用1∶20的料液比为宜，既能保证一定的得率，又能减少后续操作难度，节省材料和能耗.

2.1.3 提取时间对绿原酸得率的影响 由图3看出绿原酸的得率随着时间的延长而提高，这是由于随着浸提时间的增长，越来越多的绿原酸被溶解出来.超声波辅助处理40 min时达到提取最大值，而后随着超声波辅助时间延长，绿原酸得率有所下降.

2.2 正交试验结果与分析

正交试验结果与分析见表2.在试验范围内，得到最佳组合是A3B1C3，即料液比1∶20、乙醇浓度60%、超声时间为40 min时忍冬叶中绿原酸的得率最高，为5.34%.由极差R值分析可知，RA>RB>RC，超声波辅助法提取忍冬叶中绿原酸，影响忍冬叶中绿原酸得率的因素主次关系依次为：料液比、乙醇浓度、超声时间.

图2 料液比对绿原酸得率的影响 图3 时间对绿原酸得率的影响

表2 正交试验结果分析表

2.3 验证试验

在最佳组合A3B1C3条件下，按上述步骤进行验证性试验，做3组平行试验，结果见表3.由表3可知，样品中绿原酸平均提取率为5.21%，且RSD为0.17%，在本优选条件下重复试验的重现性较好，最佳提取条件得到验证.

表3 最佳提取条件验证实验

3 结论

本文对忍冬叶中绿原酸进行超声辅助提取，并用正交试验确定了最佳提取工艺条件：料液比1∶20、乙醇浓度60%、超声时间为40 min.试验结果为进一步加强忍冬叶资源的实际开发利用、扩大忍冬的药用部位提供科学依据.