丹七片对气滞、气虚以及寒凝血瘀模型大鼠的治疗作用研究

曲笑锋 ，于艳辉 ，唐晓桐 ，吴 萍 ，王雅俪 ，王明鑫 ，蔡秀华 ，赵伯友

（1.吉林修正药业新药开发有限公司，吉林省中药标准化关键工程技术重点实验室,长春130103；2.修正药业集团股份有限公司，通化134100）

1 材料与方法

1.1 实验药物

丹七片，浅黄棕色薄膜衣片，批号：20180705，由修正药业集团股份有限公司提供，实验前研磨成粉，0.4%羧甲基纤维素钠配置成混悬液，浓度分别为0.675、1.35、2.7 g/kg （相当与临床成人用量的 1、2、4 倍），4℃保存备用；盐酸肾上腺素注射液，购自天津金耀药业有限公司，批号：1805201；复方丹参滴丸，棕色薄膜衣滴丸，批号171222，天士力制药集团股份有限公司生产，实验前配制成浓度含生药0.1548g/kg混悬液，4℃保存备用。

1.2 动物

SPF级Wistar大鼠180只，雌雄各半，体重200~220g，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。生产许可证编号：SCXK（吉）-2016-0003。

1.3 试剂

羧甲基纤维素钠：国药集团化学试剂有限公司，批号：20181009；医用酒精：德州德新康消毒制品有限公司，批号：150809；肌酸激酶（CK）ELISA 检测试剂盒，生产批号：JL21154；肌酸激酶同工酶（CK-MB）ELISA检测试剂盒，生产批号：JL12296；Na+-K+-ATP酶ELISA检测试剂盒，生产批号：JL11832；内皮素-1（ET-1）ELISA 检测试剂盒，生产批号：JL10931；一氧化氮（NO）ELISA检测试剂盒，生产批号：JL13431。均购自上海将来实业股份有限公司。

1.4 仪器

酶标仪，厂家：Manufactured in China Designed in California USA，型号：SMP500-18272-LSIO；全自动血液流变仪，厂家：北京普利生仪器有限公司，型号：LBY-N6；电子天平，厂家：美国双杰兄弟有限公司，型号：T1000。

1.5 方法[1]

1.5.1 分组给药

取检疫合格的Wistar大鼠60只，雌雄各半。随机设立6个实验组，分别为空白对照组、模型对照组、复方丹参滴丸组（阳性组）以及丹七片高、中、低（2.7、1.35、0.675 g/kg/d）剂量组，每组10只大鼠，雌雄各半，给药组给予相对应药物，模型对照组给予纯化水，各组动物均每天灌胃给药1次，给药体积为10mL/kg。

1.5.2 模型制备

气滞血瘀模型：给药组连续给药1周，除空白对照组外，其余各组分别于给药0.5h后给予钳尾刺激，每次维持10min，每隔2h钳尾一次，一天4次，连续剌激一周。第2周于给药半小时后行钳尾刺激，每次维持10min，每隔1小时剌激1次，每天钳尾8次，于第4次钳尾之后皮下注射盐酸肾上腺素0.8 mg/kg（与生理盐水1∶3），间隔4小时后再次注射盐酸肾上腺素，空白对照组注射生理盐水，如此连续刺激1周[2]。

气虚血瘀模型[3～4]：给药组连续给药1周，除空白对照组外，其余各组每日游泳至力竭(以头沉入水中5～10s为准)连续7d制备气虚血瘀模型。空白对照组从实验开始至结束正常饮水、喂食。各组动物在实验第7 d下午禁食不禁水12 h，第8 d上午，除空白对照组外，其余各组均皮下注射盐酸肾上腺素注射液(0.8 mg/kg)制备模型，注射1 h后开始取材。

寒凝血瘀模型[5～6]：将碎冰放入水深 15～20 cm 内壁光滑的塑料圆桶中，待冰水温度至0～1℃，除空白对照组外，将各组大鼠放入圆桶，10 min后，将全身僵直大鼠取出。每天冰水浴后给予鼠粮正常饲养，各组大鼠每天按照上述造模方法造模，连续造模10d。实验开始1~5d只造模不给药，5~10d给药组给予相对应药物。

1.5.3 检测指标

检测时间：试验结束解剖当天；

检测动物：各组待解剖动物；

采血方法：样本采集前所有动物禁食至少12小时但不禁水。经1.5%戊巴比妥钠溶液麻醉 （腹腔注射1.5mL/kg）后自腹主动脉采血约3.0 mL用于血流变学检测，约2mL用于血清生化学指标检测。

血样处理方法：血流变学检测将血液置于枸橼酸钠抗凝管，立即检测；血清生化学指标检测将血液3000r/min离心10min，取上清液置于-20℃冰箱保存备用。

具体检测指标：全血黏度（低切、高切）；ELISA法检测血清中肌酸激酶 （CK）、肌酸激酶同工酶 （CKMB）、钠-钾-三磷酸腺苷酶（Na+-K+-ATP）、内皮素（ET-1）和一氧化氮（NO）。

1.5.4 统计学方法

所有数据用SPSS13.0统计软件处理，计数资料组间比较采用t检验分析法，结果以均数±标准差（x±SD）表示，以P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 动物一般状态观察

三种血瘀模型动物造模前，各组大鼠发育正常，皮毛有光泽，无脱毛等现象；自主活动正常；大小便无异常；摄食、饮水正常；对外界刺激反应灵敏。表明所选Wistar大鼠符合实验要求。

造模后，均出现皮毛无光泽，竖毛，脱毛，以及不同程度稀便现象，以模型对照组最为严重，并且气滞血瘀模型中，除空白对照组外其余各组大鼠存在不同程度厮打所致伤痕。阳性组、丹七片高、中剂量组体质量下降不明显，一般状态良好，其次为丹七片低剂量组。

2.2 丹七片对三种血瘀模型大鼠血流变学的影响

三种血瘀模型对照组与空白对照组比较，全血黏度（低切、高切）均有明显差异（P<0.05，P<0.01）。气滞血瘀模型阳性组、丹七片高、低剂量组与模型对照组比较全血黏度（高切）均有明显差异（P<0.05）；气虚血瘀模型与模型对照组比较，丹七片高剂量组全血黏度 （低切、高切）有明显差异（P<0.05），阳性组全血黏度（高切）有明显差异（P<0.05）；寒凝血瘀模型阳性组、丹七片高剂量组与模型对照组比较全血黏度（低切、高切）均有明显差异（P<0.05），丹七片中、低剂量组与模型对照组比较全血黏度（低切）均有明显差异（P<0.05），详见表1。

2.3 丹七片对三种血瘀模型大鼠血清生化学指标的影响

2.3.1 气滞血瘀模型

模型对照组与空白对照组比较，各项指标均有极明显差异（P<0.01，P<0.001）；与模型对照组比较，阳性组、丹七片高剂量组NO、Na+-K+-ATP含量明显升高（P<0.05），CK、CK-MB、ET-1 含量均明显降低（P<0.05，P<0.01，P<0.001），丹七片中剂量组除 NO、Na+-K+-ATP外其余各项指标均有明显降低 （P<0.05，P<0.01，P<0.001），Na+-K+-ATP 含量有明显升高（P<0.05），丹七片低剂量组CK、CK-MB含量均明显降低 （P<0.05，P<0.01），详见表 2。

表2 丹七片对大鼠气滞血瘀模型相关指标的影响（x±SD）

2.3.2 气虚血瘀模型

模型对照组与空白对照组比较各项指标均有显著差异（P<0.01，P<0.001）；与模型对照组比较，阳性组各项指标均有明显差异（P<0.05，P<0.01，P<0.001），丹七片高、中、低剂量组除NO外各项指标均有不同程度升高或降低， 且具有统计学意义 （P<0.05，P<0.01，P<0.001），详见表 3。

表3 丹七片对大鼠气虚血瘀模型相关指标的影响（x±SD）

2.3.3 寒凝血瘀模型

模型对照组与空白对照组比较，各项指标均有明显差异（P<0.01，P<0.001）；阳性组与模型对照组比较，除ET-1外，其余各项指标均有明显差异（P<0.05，P<0.01，P<0.001）；丹七片高剂量组与模型对照组比较，各项指标均有明显差异（P<0.05，P<0.01，P<0.001）；丹七片中剂量组与模型对照组比较，NO含量明显升高（P<0.01），CK、CK-MB 含量均明显降低（P<0.05，P<0.001）；丹七片低剂量组与模型对照组比较，NO含量有明显升高（P<0.05，P<0.01），CK 含量明显降低（P<0.001），详见表4。

表4 丹七片对大鼠寒凝血瘀模型相关指标的影响（x±SD）

3 讨论

CK是一种与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶。CK活性测定可以用于骨骼肌疾病及心肌疾病的诊断。CK-MB在临床诊断中也有十分重要的意义，在各种病变包括肌肉萎缩和心肌梗塞发生时，人血清中CK水平迅速提高，认为在心肌梗塞的诊断中测定CK的活性比做心电图更为可靠，其中CK的同工酶CK-MB诊断的特异性最高。

血瘀证是临床常见的病症，其发病是由于多种致瘀因素导致血行缓慢、脉道壅塞而致。根据致病因素不同，可分为寒凝血瘀、气滞血瘀、气虚血瘀等类型，病变可累及心、脑、肺、肾、肝、生殖等多个系统，轻者可影响患者的日常生活，重则危及患者生命[7]。因此，对血瘀证及活血化瘀药物的相关研究是中医临床与理论研究中最受国内外关注的领域之一[8]，对降低由于血瘀引起的各类病症诸如心脑血管疾病的发生率和死亡率具有重大意义。血瘀证由于病因不同，其处方用药也不尽相同，因此对血瘀证不同证型的研究，更具临床意义。本研究以此为出发点，意在探究丹七片对不同血瘀证的治疗作用，明确其疗效，为临床用药提供保障。根据中医学“气温则血滑，气寒则血凝”、“气结则血凝”、“气虚则血瘀”等病因理论，本实验采用持续性钳尾刺激、游泳力竭以及冰浴联合肾上腺素注射复合因素制备三种血瘀的大鼠模型。结果显示，造模后模型组大鼠出现体质量明显减轻、懒散倦怠、毛色枯黄、稀便等血瘀的证候，符合中医学宏观指标。同时通过血流变学检测全血黏度的增高，也提示了血瘀模型微观指标的出现[9]。

丹七片为理血剂，具有活血化瘀，通脉止痛之功效。用于瘀血闭阻所致的胸痹心痛，眩晕头痛，经期腹痛。方中以丹参微寒，活血养血，化瘀通脉；三七性温，活血止血，祛瘀定痛。二者合用可增加冠状动脉血流量；改善心肌收缩力，调整心率，调节血压；改善微循环系统，抑制血小板凝聚；降低血浆粘稠度，增加纤维蛋白溶解，是治疗心脉瘀阻、胸痹绞痛的良药[10～12]。本实验结果显示，丹七片给药组可降低三种血瘀模型的全血黏度（高切、低切），以高剂量组效果最为显著可能与抑制红细胞变形性等因素有关[13]。与空白对照组比较，模型对照组三种血瘀模型的各项指标均有显著升高或降低。与模型对照组比较，三种血瘀模型丹七片高剂量组的各项指标均有明显升高或降低，且具有统计学差异（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）； 丹七片中、 低剂量组 CK、CK-MB等主要指标有明显升高或降低 （P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。本研究获得结论：丹七片能够降低气滞、气虚、寒凝血瘀模型大鼠的全血黏度，并可通过调节CK、CK-MB、Na+-K+-ATP等相关指标抑制三种血瘀的发生和发展，为丹七片的临床用药提供理论保障。