养脾丸对脾虚证大鼠模型胃肠及免疫功能的影响

唐晓桐,曲笑锋,于艳辉,王宝成,张文恒,徐 建

（1.吉林修正药业新药开发有限公司，吉林省中药标准化关键工程技术重点实验室，长春130103；2.通药制药集团股份有限公司，通化134000）

1 材料与方法

1.1 实验药物

养脾丸，黄棕色丸，由通药制药集团股份有限公司提供，批号：170306；多潘立酮片，白色，10mg/粒，西安杨森制药有限公司生产，批号170324550；四君子颗粒，棕色颗粒，15g/袋，葵花药业集团湖北武当有限公司生产，批号1705010。实验前养脾丸研磨成粉，0.4%羧甲基纤维素钠配置成混悬液，浓度分别为0.675、1.35、2.7 g/kg （相当与临床成人用量的 1、2、4倍），4℃保存备用。

1.2 动物

SPF级Wistar大鼠70只，雌雄各半，体重200～220g，SPF级ICR小鼠60只，雌雄各半，体重18～22g，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。生产许可证编号：SCXK（吉）-2016-0003。

1.3 试剂

医用酒精：德州德新康消毒制品有限公司，批号：150809；水合氯醛：国药集团化学试剂有限公司，批号：T20140725；D-木糖 （D-xylose）ELISA 检测试剂盒，上海江莱生物科技有限公司，生产批号：201708；胃泌素（GAS），ELISA检测试剂盒，上海江莱生物科技有限公司， 生产批号：201708；β-内啡肽 （β-EP）ELISA检测试剂盒，上海江莱生物科技有限公司，生产批号：201708；胃动素（MTL）ELISA 检测试剂盒，上海江莱生物科技有限公司，生产批号：201708；生长抑素（SS）ELISA检测试剂盒，上海江莱生物科技有限公司，生产批号：201708；血管活性肠肽（VIP）ELISA 检测试剂盒，上海江莱生物科技有限公司，生产批号：201708；IgG ELISA检测试剂盒，上海江莱生物科技有限公司，生产批号：201710；IgM ELISA检测试剂盒，上海江莱生物科技有限公司，生产批号：201710。

1.4 仪器

酶标仪，厂家：Manufactured in China Designed in California USA，型号：SMP500-18272-LSIO；低温冷冻离心机，厂家：Thermo Fisher，型号：Primo 型；电子天平，厂家：美国双杰兄弟有限公司，型号：T1000。

1.5 方法

1.5.1 模型建立及分组给药

1.5.1.1 胃肠功能检测[1～2]

将造模大鼠随机等分为6组：脾虚模型组、多潘立酮组、四君子颗粒组、养脾丸高、中、低剂量组各10只。采用三因素复合的方法复制大鼠脾虚模型：a.灌胃大黄（200%、剂量 20g/kg）；b.游泳至力竭（鼻尖没入水面5s），隔天游泳；c.隔天禁食，共造模21d。造模结束后，给药组分别灌胃给予多潘立酮片（2.7mg/kg）、四君子颗粒（4050mg/kg）、养脾丸高（3480mg/kg）、中（1740mg/kg）、低剂量（870mg/kg）药液，空白对照组、模型对照组灌胃给予蒸馏水，给药体积为20mL/kg，连续7d。

1.5.1.2 免疫功能检测

a.将小鼠随机分为6组，每组10只，分别为空白对照组、模型对照组、四君子颗粒组、养脾丸高、中、低剂量组。除空白对照组外，其余5组小鼠以100%大黄煎剂1mL/只灌胃，连续给药7d，小鼠出现纳呆、食量减少、消瘦体重下降、毛发竖立、无力倦缩状，即造模成功。于第8d开始，空白对照组及脾虚模型组分别以0.4%羧甲基纤维素钠20mL/kg灌胃，其余4组分别给予四君子颗粒 （17550mg/kg）、养脾丸高剂量（6250mg/kg、）中剂量（3750mg/kg）、低剂量（1250g/kg）药液，连续7d。b.末次给药后1h，称体重，各鼠均按0.1mL/10g剂量由尾静脉注入印度墨汁 （以生理盐水按 1：5 稀释），注射后分别在 1min（t1）、10min（t2）从小鼠眼眶静脉丛取血20 μL溶于2.0 mL 0.1%Na2CO3溶液中摇匀，放置20min后680 nm处测其吸光度值（A），以0.1%Na2CO3溶液做空白对照。

1.5.2 检测指标

1.5.2.1 一般状态观察

日常观察大鼠的自发活动，大便性状，逐日记录摄食量及体重变化情况。

1.5.2.2 血液指标

胃肠功能检测：末次给药1h后，腹主动脉采血4 mL，平均置于2只试管中 （其中一支管中加入10%NA-EDTA 及 抑 肽 酶 各 30μL），2000 r/min 离 心 5 min，取上清，-20℃保存备用。按照ELISA检测试剂盒要求，测定血清 GAS、血清 D-xylose，血浆 β-EP[3]、MTL、VIP、SS[4]。

免疫功能检测[5～7]：末次给药1h后，各组小鼠眼球取血，3500 r/min离心15 min，检测血清中IgM和IgG含量。将小鼠处死后取肝脏、脾脏和胸腺，称重，根据公式计算廓清指数K值和吞噬指数α值。

式中：t1、t2分别为取血时间；A1、A2分别为在时间t1、t2时所取血样对应的吸光度。

1.5.3 统计分析

采用DAS1.0进行统计分析，将每项指标以均数±标准差（X±SD）表示。

2 结果

2.1 对脾虚证大鼠治疗作用及对胃肠激素的影响

2.1.1 对大鼠摄食量和体重的影响

采用三因素复合的方法复制脾虚模型后，与空白对照组比较，模型组动物逐渐出现便溏、肛门污秽、消瘦、活动逐渐减少、拱背、毛发干枯无光泽等症状。给药后，各治疗组大便逐渐变稠到干，活动增多，毛发蓬松有光泽接近空白对照组。造模前，各组动物间体重无明显差异；连续造模21d后，空白对照组大鼠体重呈正常增长趋势；与空白对照组比较，造模大鼠体重均增长缓慢，甚至出现负增长，造模结束后各组体重均低于空白对照组；给药7天后，与模型组比较 ，除多潘立酮组外其余各给药组动物体重增长均无明显差异，各给药组动物摄食量均无明显差异，详见表1。

表1 对大鼠摄食量和体重的影响（X±SD，n=10）

2.1.2 对血清GAS、D-xylose的影响

与空白对照组比较，模型组血清GAS、D-xylose含量明显降低（P<0.001），与模型组比较，多潘立酮组、四君子颗粒组、养脾丸高、中、低剂量组能增加血清中 GAS 含量（P<0.05，P<0.01，P<0.001），养脾丸中剂量组还可增加D-xylose含量（P<0.05），详见表2。

表 2 对血清 GAS、D-xylose 的影响（X±SD，n=10）

2.1.3 对血浆 β-内啡肽（β-EP）、胃动素（MTL）、生长抑素（SS）、血管活性肠肽（VIP）的影响

与空白对照组比较，模型组血浆β-EP、MTL、SS、VIP 明显降低（P<0.05、P<0.01），与模型组比较，多潘立酮组、四君子颗粒组、养脾散组、养脾丸高、中、低剂量组能增加血浆 β-EP 含量 （P<0.05，P<0.01，P<0.001）；多潘立酮组、四君子颗粒组、养脾丸中剂量组能增加血浆MTL含量（P<0.05，P<0.01）；多潘立酮组、四君子颗粒组、养脾丸高、低剂量组能增加血浆中SS含量（P<0.05，P<0.01，P<0.001）；各组对 VIP 无明显作用，详见表3。

表 3 对血浆 β-EP、MTL、SS、VIP 的影响（X±SD，n=10）

2.2 对脾虚证小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的影响

2.2.1 对廓清指数、吞噬指数的影响

与空白组比较，脾虚证小鼠廓清指数、吞噬指数明显降低（P<0.05，P<0.001）；与模型组比较，多潘立酮组、四君子颗粒组、养脾丸高、中、低剂量组均可明显提高小鼠廓清指数（P<0.001）；养脾丸中、低剂量组可明显提高吞噬指数（P<0.05），详见表4。

表4 对廓清指数、吞噬指数的影响（X±SD，n=10）

2.2.2 对血清IgG、IgM的影响

与空白组比较，脾虚证小鼠IgG明显降低 （P<0.001）；与模型组比较，四君子颗粒组、养脾丸中、低剂量组均可明显提高小鼠血清IgM含量 （P<0.05，P<0.01）；养脾丸中剂量组可明显提高血清中IgG含量（P<0.01），详见表 5。

表 5 对小鼠血清 IgG、IgM（X±SD，n=10）

3 讨论

建立人类疾病的动物模型，要先找到人类发病的致病因素，再来创造最能贴近人类发病的条件，从而使动物患上和人类类似的疾病。因此，找到发病的病因是建立动物模型的基础[8]。本实验采用了复合多因素造模法成功地制备了脾虚证动物模型，通过灌胃大黄、游泳力竭和隔日禁食多因素共同作用，使大鼠出现脾虚的症状，从一般行为状态来观察大鼠，模型组大鼠出现便溏、肛门污秽、消瘦、活动逐渐减少、拱背、毛发干枯无光泽，对外界的刺激做出的反应也不及空白对照组快。同时造模前，各组动物间体重无明显差异，连续造模21d后，造模大鼠体重增长缓慢，甚至出现负增长，造模结束后各组体重均低于空白对照组，且模型组大鼠的摄食量与空白对照组相比，显著降低（P＜0.001），并且解剖大鼠后，发现无其他器质性病变，说明动物模型建立成功。

枳实消痞丸源自李东垣的《兰室秘藏》，由半夏泻心汤合枳术汤加减而来，原书中记载其“治右关脉弦，心下虚痞，恶食懒倦，开胃进食”[9]。方中枳实为君药，功能行气消痞；厚朴为臣药，效能除满下气；枳实和厚朴相须为用，增加破气除满和散痞的功效。佐药黄连苦寒，效能燥湿清热；半夏功能消痞散结；干姜具有温中散寒、温肺化饮之功。最后再佐麦芽曲和胃消食；四君子汤益气健脾，化湿和中；使药甘草调和诸药。全方消补兼用，同调寒热，辛开苦降[10]。枳实消痞丸已广泛应用于临床治疗实践中。

为判断疗效本研究选择了与胃肠功能和免疫功能息息相关的指标进行检测。MTL为消化道激素之一，是由22个氨基酸组成的多肽，分布在全部小肠，其作用是促进和影响胃肠运动及胃肠道对水、电解质的运输。GAS是一种重要的胃肠激素，它主要由G细胞分泌。G细胞是典型的开放型细胞，以胃窦部最多，其次是胃底、十二指肠和空肠等处。近年发现，颊粘膜、舌、食道、中枢神经系统也含有胃泌素。1978年，Rehfeld[11]证明人的脑脊液和某些脑组织中存在胃泌素，胃泌素几乎对整个胃肠道均有作用，它可促进胃肠道的分泌功能，增加胃肠道的运动，松弛幽门括约肌、胆道口括约肌和回盲部括约肌，促进胃及上部肠道粘膜细胞的分裂增殖以及促进胰岛素和降钙素的释放。IgG是血清主要的抗体成分，约占血清Ig的75%～80%[12]。其中 40～50%分布于血清中，其余分布在组织中。IgG是唯一可以通过胎盘的免疫球蛋白。IgG的功能作用主要在机体免疫中起保护作用，大多数抗菌、抗病毒；应对麻疹、甲型肝炎等，能有效地预防相应的感染性疾病。由此可见，MTL、GAS、IgG等相关指标在胃肠功能和免疫功能中体现出的重要性。研究结果显示：胃肠功能检测中，与空白对照组比较，模型组各指标含量明显降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）；与模型组比较，各给药组可使MTL、GAS等大多数主要指标的含量明显增加（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。免疫功能检测中，与空白组比较，脾虚证小鼠廓清指数、吞噬指数以及血清 IgG 明显降低（P＜0.05、P＜0.001）；与模型组比较，各给药组均可明显提高小鼠廓清指数（P<0.001）；养脾丸中、低剂量组可明显提高吞噬指数（P<0.05）；四君子颗粒组、养脾丸中、低剂量组可明显提高小鼠血清 IgM 含量（P＜0.05、P＜0.01）；养脾丸中剂量组还可明显提高血清中IgG含量（P＜0.01）。本实验研究结论：养脾丸可一定程度调节脾虚所致胃肠激素分泌失调，使相关指标获得改善，提升胃肠功能，同时还具有提高机体免疫力的作用。