快速溶剂萃取仪提取人参多糖的工艺研究

王国明，徐清华，徐芳菲，李 蕾，谢丽娟，郭畅冰，查 琳，杨怀雷，曹志强

（吉林人参研究院·吉林通化·134001）

人参（Panax ginseng C.A.Mey.）为五加科植物的干燥根及根茎，具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津养血、安神益智的功能[1]。人参多糖是人参重要的活性成分，发挥着重要作用。现代药理研究表明，人参多糖具有生物免疫调节功能，如抗肿瘤、抗疲劳、抗衰老、预防老年痴呆、调节血糖及血脂[2～12]等。近年来有关植物多糖的化学结构、生物功能和提取工艺等方面的研究越来越多，目前为止，多糖的提取方法有热水浸提法、酶提取法、微波辅助提取法、溶剂提取法、超声波提取法等[13～16]。快速溶剂萃取与其他提取法相比，可有效提高提取分离率，缩短提取时间、节约成本，甚至还可以提高产品的质量和产量，而且因为该提取方法是一个物理变化过程，能在一定时间内保持多糖性质的稳定。其研究受到了广泛关注[17]。

快速溶剂萃取技术（Fully Automatic Rapid Solvent Extraction，APLE）是一种专用于固体、半固体样品的快速样品预处理装置，萃取时间为几分钟至数十分钟，溶剂消耗为几毫升至几十毫升，整个操作过程均采用完全密闭处理，有效的减少了有机溶剂的挥发，以及实验室人员接触有机蒸汽的时间，环境友好，健康安全。它是近年来刚刚发展起来的技术，因其具有提取效率高、在线净化、快速和节省溶剂的特点，已被美国国家环保局（EPA）写入标准方法。近年来，国内也在快速溶剂萃取前处理技术上开展大量的研究，快速溶剂萃取技术已经被国家标准(GB/T 19649－2006)指定为样品萃取技术，然而用快速溶剂萃取法提取人参多糖的文献报道较少，因此该技术在人参多糖成分的提取还有很大的发展空间，还需要进行细致深入的研究工作。

本文将利用快速溶剂萃取法提取人参多糖，从萃取压力、加热温度、萃取时间、循环次数为辅助指标，建立人参多糖的最佳提取条件，以期对以后的研究有借鉴价值。

1 材料与方法

1.1 材料

材料与试剂 ：人参药材（吉林省通化地区），葡萄糖（国药集团），苯酚（北京化工厂），浓硫酸（北京化工厂）。

仪器与设备：快速溶剂萃取仪（APLE-2000北京吉天有限公司），紫外可见分光光度计（上海光谱仪器设备有限公司SP-1920），电子天平 （赛多利斯SQP型），离心机（湖南湘仪TDZ5-WS），圆周振荡器（德国IKA Lab-Dancer），真空干燥箱（上海慧泰 DZF-6050），数显恒温水浴锅（金坛白塔HH-6）。

1.2 实验方法

1.2.1 试样预处理

将人参清洗后置于真空干燥箱内烘干至质量恒定，之后用中药粉碎机进行粉碎，过100目筛，粉末置于密封袋内保存备用。称取300g样品加入95%乙醇6000mL，加热浸提2h，抽滤，弃去滤液，除去色素、脂质类及溶于醇的杂质。滤渣60℃烘干即得人参试样。

1.2.2 APLE提取人参多糖

称取1g人参试样，与2g硅藻土充分混合，装入萃取池，再用适量硅藻土填充萃取池，以蒸馏水为溶剂，设计不同的加热温度、循环次数、萃取压力、萃取时间，开始快速萃取。萃取完成后，取出收集瓶，加水定容至100mL，待测。

1.2.3 热水辅助提取人参多糖

称取人参试样3g，按照1∶30的料液比进行90℃加热浸提，提取时间分别为2h、1h、1h，离心后将上清液合并，加水定容至300ml，待测。

1.2.4 超声波辅助提取人参多糖

称取人参试样3g，加90ml水浸泡6h，超声温度为70℃，超声功率为50kHz，超声40min，离心后将上清液合并，加水定容至300ml，待测。

1.3 人参多糖含量的测定

1.3.1 葡萄糖标准曲线绘制

配置浓度为10mg/mL的无水葡萄糖标准溶液，用前稀释50倍为使用液。精密吸取葡萄糖标准使用液0、325、650、975、1300、1625 μL 置于 50mL 试管中（相当于质量为 0、65、130、195、260、325μg）， 补加水至2.0mL，加入5%苯酚溶液1.0mL，在圆周振荡器混匀，小心加入浓硫酸10.0mL，在圆周振荡器小心混匀，置沸水浴中加热2min，取出，冰浴2min，冷却至室温，于485nm波长处以试剂空白未参比测定吸光度。以吸光度（A）为纵坐标，葡萄糖质量为横坐标绘制标准曲线，详见图1，得到回归方程为：y=3.002x+0.010（R2=0.999）。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose

1.3.2 人参多糖试样含量测定

准确量取5mL于离心管中，加入20mL无水乙醇，置于冰箱冷藏4h以上，3500r/min离心5min，弃去上清液，缓慢加入10mL 80%乙醇洗涤沉淀，再次离心，弃去上清液，反复操作3次，残渣挥干后加水溶解，定容至25mL，精密量取该溶液1mL，补加水至2.0mL，加入5%苯酚溶液1.0mL，在圆周振荡器混匀，小心加入浓硫酸10.0mL，在圆周振荡器小心混匀，置沸水浴中加热2min，取出，冰浴2min，冷却至室温，于485nm波长处以试剂空白未参比测定吸光度。计算多糖提取率（%）。

式中，X为样品中粗多糖含量（%）;

m1为被测液葡萄糖质量（mg）;

m2为样品称样质量（g）;

V1为样品提取液体积（mL）;

V2为沉淀粗多糖所用提取液体积（mL）;

V3为粗多糖液体积（mL）;

V4为比色管中测定液吸取体积（mL）;

0.9 为葡萄糖换算为粗多糖换算系数。

2 结果与分析

2.1 APLE萃取多糖的单因素实验

2.1.1 萃取压力的确定

APLE2000快速溶剂萃取仪分别设计不同萃取压力 6、8、10、12、14、16MPa， 结果见图 2。 提取压力为8Mpa时，提取率最高，压力继续增大，多糖提取率逐渐降低。因此，8Mpa为最佳萃取压力。

图2 萃取压力对人参多糖提取率的影响Fig.2 Effect of pressure on polysaccharide yield in Chinese chestnut

2.1.2 循环次数的确定

APLE2000快速溶剂萃取仪分别设计循环1次、2次、3次、4次、5次开始快速萃取。萃取完成后，取出收集瓶，加水定容至100mL，结果见图3，随着循环次数增多，人参多糖提取率逐渐升高，因此，选定的正交实验循环次数分别为3、4、5次。

图3 循环次数对人参多糖提取率的影响Fig.3 Cycle times on polysaccharide yield in Chinese chestnut

2.1.3 提取时间的确定

APLE2000 快速溶剂萃取仪分别设计 1、3、6、9、12min开始快速萃取。萃取完成后，取出收集瓶，加水定容至100mL，结果见图4，随着提取时间增加，人参多糖提取率逐渐升高，6min之后趋于平稳，6、9、12min的多糖提取率相差不大，为了节约时间成本，因此，选定的正交实验循环次数分别为6、7、8min。

图4 提取时间对人参多糖提取率的影响Fig.4 Effcet of time on polysaccharide yield in Chinese chestnut

2.1.4 加热温度的确定

APLE2000快速溶剂萃取仪分别设计不同加热温度 60、80、100、120、140、160℃开始快速萃取， 循环 2次。萃取完成后，取出收集瓶，加水定容至100mL，结果见图5，提取过程中，温度过低，溶剂的渗透能力和溶解能力较低，多糖不易渗出；温度过高，不仅消耗热量较高，提取液中杂质也随着增加，另外多糖活性也会降低。如下图可见，人参多糖提取率随着温度的增加而增加，一方面可能是因为加热导致分子的运动加快，溶质之间的碰撞增加，细胞壁溶胀破碎增加。另一方面可能是因为随着温度的增高，多糖的晶态高聚物转变为非晶态后，溶剂分子渗入到多糖高分子内部而逐渐溶解多糖，从而提高了提取率，但高温会使人参淀粉糊化，人参淀粉降解成单糖[18]。因此，选定的正交实验循环次数分别为 100、1201、140℃。

图5 提取温度对人参多糖提取率的影响Fig.5 Effcetoftemperture on polysaccharide yield in Chinese chestnut

2.2 APLE萃取人参多糖正交实验工艺优化

在单因素基础上，萃取压力为8Mpa，对加热温度，循环次数，萃取时间为进行考察，进行L9（34）正交实验，获得最佳提取工艺，正交实验具体因素水平如表1所示。正交实验结果见表2，3个因素对人参多糖提取率的影响次序为加热温度＞循环次数＞萃取时间，根据显著性检验确定的最佳提取工艺条件为A3B3C2。即加热温度为140℃，循环次数为5次，萃取时间为9min。由方差分析表3可知，加热温度对多糖的提取了的影响显著，循环次数和萃取时间对多糖提取率影响不显著。

表1 正交实验设计的因素与水平Table 1 Factors and levels in orthogonal esperimental design

表2 人参多糖提取正交实验结果Table 2 Orthogonal test results of polysaccharide extraxtion in Panax Ginseng

表3 方差分析结果Table 3 Result of variance anaysis

图6 效应曲线图Fig.6 Effect diagram

2.3 验证性实验结果

为了验证正交实验结果的可靠性，根据最佳提取条件进行了3次平行验证性实验，在加热温度140℃，循环次数为5次，萃取时间为9min的条件下，人参多糖的实际提取率分别为11.18%、11.39%、11.29%，表明该工艺稳定可行，具有实际应用价值。

2.4 三种人参多糖提取方法的比较

根据正交实验所确定的APLE萃取人参多糖的最佳条件进行多糖提取，结果得出，人参多糖的提取率为11.36%，与热水辅助提取、超声波辅助提取法进行比较，结果见表4。APLE提取人参多糖含量与超声波提取含量差别不大，是传统热水辅助提取人参多糖含量的1.7倍，快速溶剂萃取法用时最短，提取溶剂用量少，提取率高，是一种绿色高效的提取技术，其他两种方法用时、用量均比快速溶剂萃取法高，可见APLE萃取法可以为人参多糖的提取提供一种新方法。

表4 不同提取方法比较Table 4 Comparison of different extraction methods

3 结论

本实验结果表明，APLE快速溶剂萃取人参多糖的最佳工艺为加热温度为140℃，循环次数为5次，萃取时间为9min。在最优条件下，人参多糖提取率为11.36%，APLE法和超声波辅助提取所得粗多糖的含量差别不大。与水提法相比，样品处理时间由4 h降低至约0.5 h，大幅度提高样品处理效率，并且人参多糖提取率提高了70%。

快速溶剂萃取技术在加压加温条件下进行样品提取，分子运动能力提高，扩散加强，在提取过程中溶剂始终保持液态，保证其与样品有最大接触面积，且溶剂粘度降低易于进入样品基质，在高温条件下从而加速提取过程，完成1次提取一般仅需27 min；萃取时间缩短了，可以保证萃取物热降解减少；溶剂用量少，1g样品仅需60 mL溶剂，操作使得提取步骤只发生在同一个萃取池，避免了传统方法由于过滤、转移等操作而造成的样品损失；萃取效率高，显著降低了单个样品的提取成本；而且使用方便，安全性好，自动化程度高，APLE法是一种有效的人参多糖提取方法，对人参多糖的工艺研究具有一定的实际价值。