GC-MS/MS法测定烟草中的57种酯类香味成分

赵嘉幸，陈 黎，任宗灿，王晓瑜，崔华鹏，谢复炜，刘惠民

中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2 号 450001

酯类香味物质是烟草中常用的一类香料，对卷烟风味有重要贡献。研究表明，单体酯类通常具有甜味、果香或葡萄酒香气，与烟草香气协调；混合酯类可赋予烟气特定的气味，抑制刺激性，使烟草香味柔和，并且在适宜用量范围内一般不会对卷烟香气有负面作用［1-3］。然而，目前对烟草中重要酯类香味成分的检测方法鲜见报道。烟草组成成分繁杂，且大部分酯类香味成分质量分数低，因此高效灵敏的检测手段必不可少。

目前对烟草中香味成分的提取方法主要包括水蒸气蒸馏法［4］、固相微萃取法［5］、吹扫捕集法［6］、超临界萃取法［7］、顶空萃取法［8］、同时蒸馏萃取法［9］等，这些方法存在加热时间长或费用昂贵等问题。QuEChERS 前处理方法具有快速、简便、廉价、高效、安全、低温等优点［10］，目前已广泛用于农药或兽药残留、法医鉴定、毒品检测以及环境监测等方面［11-15］。目前对于烟草酯类香味成分的检测主要基于非靶标GC/MS 内标相对定量方法，仅能测定可准确定性的化合物。受样品基质干扰等问题制约，所检测的指标一般低于10 种，且灵敏度、通量均不能满足实际应用的需求。而GC-MS/MS 技术［16］具有多靶标、高通量、高灵敏度、日间平行性好、线性范围宽等优点，目前已广泛应用于农药残留、食品风味检测及环境监测［17-20］等方面。

本研究中通过对国内外烟草添加剂名单、烟草成分分析文献的整合、梳理，筛选出57 种对烟草感官品质有影响的关键酯类香味成分。通过对样品前处理、色谱-质谱条件优化，建立了酸性条件泡发、乙腈提取、无水MgSO4除水、GC-MS/MS 同时测定烟草中57 种关键酯类香味成分的分析方法，并建立标准曲线对这些成分的标准样品进行绝对定量，使用t 检验和偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）筛选出差异成分并成功区分出不同风格的卷烟，旨在为烟草酯类香味成分分析提供方法参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

烟末（2016 年云南曲靖产C3F）；15 种市售商品卷烟：1#～5#为清香风格卷烟，6#～10#为苔香风格卷烟，11#～15#为焦甜风格卷烟。

QuEChERS萃取试剂盒（4 g MgSO4+1 g NaCl）、分散固相萃取试剂盒（50 mg PSA（N-丙基乙二胺）+150 mg MgSO4）（美国Agilent 公司）；57 种酯类标准品（＞98%，分别购自美国Sigma-Aldrich 公司、日本TCI 公司、北京百灵威科技有限公司）；苯乙酮-d8（98 atom% D，美国Sigma-Aldrich 公司）；乙腈（色谱纯，美国J T Baker 公司）；二氯甲烷（色谱纯，德国Chemicell 公司）。

Sin-QuEChERS Nano 简单基质小柱（包括2 g Na2SO4、0.8 g MgSO4、90 mg PSA）、Sin-QuEChERS Nano 复杂基质小柱（包括2 g Na2SO4、0.6 g MgSO4、60 mg PSA、30 mg GCB（石墨化炭黑）和25 mg MWCNTs（多壁碳纳米管））（北京绿绵科技有限公司）；7890B-7000D 气相色谱/三重四极杆质谱联用仪（美国Agilent 公司）；EOFO-945066 多管式旋涡混合器（美国Talboys 公司）；3-30KS 高速冷冻离心机（德国Sigma公司）；Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司）。

1.2 样品前处理

称取2 g 烟末样品于50 mL 具塞离心管中，加入10 mL 磷酸盐缓冲液，调pH 为3，涡旋使样品完全浸润，静置5 min；加入10 mL乙腈以及80 μL 30.0 mg/L苯乙酮-d8内标工作液，以2 500 r/min 涡旋10 min，而后放入-18 ℃的冰箱中冷冻10 min。取出后加入4 g 无水硫酸镁、1 g 氯化钠并迅速振摇，再以2 500 r/min 涡旋2 min，7 000 r/min 离心3 min；取1.5 mL 上清液，加入0.2 g 无水硫酸镁，立即以2 500 r/min涡旋2 min，7 000 r/min 离心3 min；然后将上清液过0.22 μm 有机相滤膜后进行GC-MS/MS 检测。检测条件：

色谱柱：DB-5MS UI 弹性石英毛细管色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），进样口端串联预柱（5 m×0.25 mm）；进样口温度：280 ℃；程序升温：75 ℃（5 min）进样模式：不分流进样，不分流时间1 min；载气：氦气（99.999%），恒流模式，流速1.5 mL/min；进样量：0.8 μL。电离模式：电子轰击（EI）；电离能：70 eV；灯丝电流：35 μA；离子源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃；传输线温度：280 ℃；Q2碰撞气：氮气（99.999%），流量1.5 mL/min；淬灭气：氦气（99.999%），流量2.25 mL/min；扫描方式：多反应监测（dMRM）。MassHunter 工作站用于仪器控制和数据处理。

2 结果与讨论

2.1 酯类化合物及内标化合物的筛选

通过对烟草添加剂以及烟草成分分析文献的整合、梳理及筛选，选择对感官质量影响较大的57 种酯类化合物，如表1 所示。

2.2 质谱条件的优化

需要优化的质谱参数主要有母离子、子离子和碰撞能量。首先将各化合物进行全扫描（Full scan）分析（m/z 20～330），确定保留时间及一级质谱图，并筛选2～4 个质荷比（m/z）及丰度较大的离子作为备选母离子；再将上述各母离子在不同的碰撞能量（5、10、15、20、25、30、35、40 eV）下进行产物离子扫描（Product ion scan），每个化合物筛选出4～8 对离子对及最优碰撞能量；最后，用选择多反应监测模式（dMRM）分析标准溶液、基质提取液、添加标准品的提取液，选择抗干扰能力强、灵敏度高的两对离子对分别作为定量及定性离子对。57 种酯类化合物及内标的保留时间、母离子、子离子及碰撞能量见表1，其中二氢茉莉酮酸甲酯具有顺式、反式2 种构型，在结果中表现出2 个色谱峰、2 个保留时间。

表1 57 种酯类化合物及其内标的MRM 参数Tab.1 MRM parameters of 57 esters and internal standard

表1 （续）

2.3 提取方式的选择

烟草香味成分的提取目前多采用同时蒸馏萃取（SDE）法，而QuEChERS 法具有简便、高效等优点。以提取效率为标准，对比了同时蒸馏萃取法与QuEChERS法两种前处理方式，并预先对同时蒸馏萃取法进行了优化。同时蒸馏萃取具体操作步骤如下：

称取10 g 烟末，加入10 mL 泡发液（含10 mL H2O、0.55 g一水合柠檬酸以及3 g NaCl）泡发30 min，加入120 mL二氯甲烷（含3.045 μg/g 苯乙酮-d8内标）超声0.5 h，过滤至1 000 mL 平底烧瓶中；将装有提取液的1 000 mL烧瓶装在同时蒸馏萃取装置的一端，放入60 ℃水浴锅中，另一端装入100 mL 平底烧瓶，同时蒸馏萃取1 h。将100 mL平底烧瓶端放入60 ℃水浴锅中；将装有350 mL H2O 和90 g NaCl 的1 000 mL 平底烧瓶放入电热套中，调节电热套功率为0.3 kW，同时蒸馏萃取1.5 h，待冷却后取下100 mL 平底烧瓶，加入无水Na2SO4干燥过夜。在常压，水浴40 ℃的条件下旋转蒸发浓缩至1～2 mL。过0.22 μm 有机相滤膜，进行GC-MS/MS 分析。

分别使用同时蒸馏萃取法和QuEChERS 法对样品烟末进行提取，GC-MS/MS 法检测，结果如图1 所示。使用QuEChERS 法和同时蒸馏萃取法分别提取出14 和13 种化合物，差异化合物为丁酸苯乙酯。共同提取出的13 个化合物中，以可提取出化合物的绝对响应计，QuEChERS 法和同时蒸馏萃取法的提取结果绝对响应较高的分别有6 和7 种。其中异丁酸香叶酯、水杨酸苄酯、苯乙酸茴香酯、甲酸苄酯及乙酸苯乙酯5 种酯类QuEChERS 法的提取效率显著高于同时蒸馏萃取法。同时蒸馏萃取法在提取时温度较高，有三丁胺等副产物产生，并且操作繁琐，耗时较长；而QuEChERS 提取法提取条件温和，易于大批量制备，耗时短。因此，选择QuEChERS 提取法作为前处理方法。

图1 同时蒸馏萃取法与QuECHERS 法的提取效率对比Fig.1 Comparison of extraction efficiencies between SDE and QuECHERS methods

2.4 提取溶剂的选择

文献报道的烟草中香味成分检测的提取溶剂多为二氯甲烷，乙腈在多组分分析中应用较为广泛。因此本研究中以目标化合物在实际样品中的提取效率为指标，考察了二氯甲烷和乙腈两种溶剂。如图2 所示，用乙腈作为提取溶剂时，共提取出14 种目标物；而二氯甲烷提取液中仅检测出9 种酯类目标物，丁酸苯乙酯、苯甲酸苄酯、异丁酸香叶酯、水杨酸苄酯及甲酸苄酯均未检出。除十八烷酸甲酯和硬脂酸乙酯外，同一目标物在乙腈提取物中的浓度明显高于二氯甲烷提取物。结果表明，乙腈的提取效率显著高于二氯甲烷。并且乙腈作为提取溶剂时，色谱峰型优于二氯甲烷，3 次平行实验的相对标准偏差更小，实验平行性更好。因此，选择乙腈作为提取溶剂。

图2 二氯甲烷与乙腈的提取效率对比（n=3）Fig.2 Comparison of extraction efficiencies between dichloromethane and acetonitrile（n=3）

2.5 泡发液pH 的优化

烟草中含有大量烟碱，提取液中烟碱浓度过高会降低色谱柱柱效，并导致烟碱附近出峰物质的保留时间漂移。因此，拟采用降低pH的方式降低提取液中烟碱浓度以消除其对目标物检测的影响。样品烟末经超纯水泡发后pH 约为5.6。使用磷酸及磷酸二氢钠盐缓冲液将样品烟末泡发后pH 分别调节至3.0 和4.0。考察了不同pH条件下各目标物的提取效果以及提取液中烟碱浓度的差异。由于烟碱浓度过大，图3 中的响应值为其实际响应的十万分之一。pH为4.0 及5.6 时，烟碱浓度极高，pH为3.0 时其浓度显著降低，仅是pH 为5.6 时的3%左右。烟叶样品中可检测到的14 种酯类化合物中，丁酸苯乙酯、异丁酸香叶酯、水杨酸苄酯和乙酸苯乙酯在pH 为3.0 时的提取效率明显优于pH 为4.0 及5.6 时，苯乙酸茴香酯和十六烷酸甲酯在pH为3.0时的提取效率不及pH为4.0 和5.6 时，但其响应较高，pH 为3.0 时仍能满足检测需要，其余化合物在不同pH时的提取效率无显著性差异。因此，选择在pH 为3.0 时进行泡发。

图3 不同泡发pH 对提取效率的影响（n=3）Fig.3 Effects of soaking pH value on extraction efficiency（n=3）

2.6 泡发时间的选择

在pH 为3.0 条件下考察了不同泡发时间对实际样品中目标物提取效率的影响，时间分别为0（即不泡发）、5、10、20、30 min，其对各目标物最终的提取效率如图4 所示。结果表明，泡发时间对提取效率没有明显影响。然而不泡发时，提取液中含有较多烟碱，不利于后续检测。因此，选择泡发提取效率相对较高、用时相对较短的泡发时间，即泡发5 min。

图4 不同泡发时间对提取效率的影响（n=3）Fig.4 Effects of soaking time on extraction efficiency（n=3）

2.7 涡旋时间的选择

考察了涡旋时间分别为2、5、10、20、30 min 时对实际样品的提取效率，结果如图5 所示。苯乙酸茴香酯、十六烷酸甲酯、棕榈酸乙酯、十八烷酸甲酯、9-十八烯酸甲酯随涡旋时间延长，提取效率有增加的趋势；丁酸苯乙酯、异丁酸香叶酯、水杨酸苄酯随提取时间延长，提取效率降低；其余目标物的提取效率随提取时间延长变化趋势不明显。综合以上结果，涡旋时间选择为10 min。

图5 不同涡旋时间对提取效率的影响（n=3）Fig.5 Effects of vortexing time on extraction efficiency（n=3）

2.8 净化剂的选择

考察了4 种不同净化方式对烟草样品提取液的净化效果及对目标物的吸附效应：取1.5 mL 上清液于离心管中，加入200 mg 无水硫酸镁或50 mg PSA和150 mg 无水硫酸镁；分别取Sin-QuEChERS Nano简单基质小柱、Sin-QuEChERS Nano 复杂基质小柱，置于有提取液的50 mL 离心管中，缓慢下压至刻度处，吸取上清液，过0.22 μm有机相滤膜。结果表明，若提取液不净化，含水率约为10%；加入150 mg 无水硫酸镁后，含水率降为3%，对仪器更加友好。图6 为各方式净化后目标化合物的响应值。可以看出，用PSA净化时，对部分目标物吸附严重，丁酸苯乙酯、异丁酸香叶酯均无法检出，除苯乙酸茴香酯外，其他目标物均有不同程度吸附；用Sin-QuEChERS Nano简单基质小柱净化时，苯甲酸苄酯、异丁酸香叶酯、十五烷酸甲酯吸附严重，无法检出，除苯乙酸茴香酯外，其他目标物均有不同程度吸附；而使用Sin-QuEChERS Nano 复杂基质小柱净化时，苯甲酸苄酯、异丁酸香叶酯、水杨酸苄酯、十四烷酸甲酯、十五烷酸甲酯、9-十八烯酸甲酯均无法检出，其余均有不同程度吸附。因此，最终使用无水MgSO4除水。

图6 不同净化方式对提取效率的影响（n=3）Fig.6 Effects of purification methods on extraction efficiency（n=3）

2.9 基质效应

本研究中通过公式（1）考察了57 种酯类香味成分的基质效应：

式中：A 为溶剂标准工作溶液标准曲线的斜率；B 为基质匹配标准工作溶液标准曲线的斜率。

基质效应越接近1，说明基质效应越不明显。结果表明，11种目标物的基质效应均不明显（0.9 ＜ME ＜1.1）；有24 种目标物存在基质减弱效应（ME ＜1.0），33 种目标物存在基质增强效应（ME ＞1.0），其中苯甲酸苄酯、肉桂酸苄酯、苯乙酸茴香酯、9-十八烯酸甲酯、苔色酸乙酯5 种酯类化合物存在明显的基质效应，使用纯溶剂标准工作溶液绘制标准曲线时，除高浓度点外，较低浓度点无信号响应，但其基质匹配标准工作溶液线性关系良好（表2）。因二氢茉莉酮酸甲酯有两个峰，故总共有58 个色谱峰。因此，采用基质匹配标准工作液以校正基质效应引入的定量误差。

对比河南、广西、黑龙江及云南4 个产地的烟叶表明，云南烟叶（C3F，2016年）含有较少的目标成分，因此选择云南烟叶提取液作为基质空白提取液。基质匹配标准曲线配制方法：预先使用乙腈配制混合母液（100 mg/mL），而后以基质空白提取液作为稀释剂配制目标浓度的工作液。

2.10 方法评价

为了减少基质效应的影响，采用基质匹配标准工作溶液绘制标准曲线，标准工作溶液浓度为10、20、50、100、200、500、1 000 ng/mL。其中有6 种化合物由于基质中质量分数较高等原因，标准曲线绘制范围不同。十八烷酸甲酯、9-十八烯酸甲酯、乙酸己酯和丁酸环己酯4 种化合物，无10 ng/mL 点；甲酸苯乙酯无10、20 ng/mL点；十六烷酸甲酯标准工作溶液的浓度为100、200、500、1 000、2 000、5 000、10 000、20 000 ng/mL。考察0.05、0.50、5.00 mg/kg 3 个水平的加标回收率，以10 倍信噪比作为方法定量限。如表3 所示，各化合物均有良好的线性关系（r2＞0.99），平均回收率范围为62.5%～128.7%，RSD 在0.5～25.4%之间。以平均回收率为60%～120%且RSD＜20%为标准，在低添加水平下，47 个化合物达到标准；在中、高添加水平下，57个化合物全部达到标准。定量限为3～74 μg/kg，其中有50个化合物的定量限≤50 μg/kg。另由于二氢茉莉酮酸甲酯具有2 个异构体，其方法学性质不同，分别列出。该方法具有良好的精密度、灵敏度，可满足分析检测需要。

表2 57 种酯类化合物在烟草提取液中的基质效应Tab.2 Matrix effects of 57 esters in tobacco extract

表3 57 种酯类化合物的相关系数、回收率（n=5）、相对标准偏差和定量限Tab.3 Correlation coefficients, recoveries (n=5), relative standard deviations (RSDs)and limits of quantification (LOQs) of 57 esters

表3 （续）

2.11 实际样品检测结果分析

用该方法检测了15 个不同风格的卷烟样品，共检出了31 种酯类化合物，其中十六烷酸甲酯的质量分数最高，其次是十八烷酸甲酯、棕榈酸乙酯和9-十八烯酸甲酯，见表4。在可检出的化合物中，以P值小于0.05 为标准，使用t 检验筛选出8 种具有显著性差异的成分，如表5 所示。使用最小二乘法判别分析该8 种酯类，结果见图7。可知，不同风格的卷烟呈显著性差异，其中苔香风格与焦甜风格组内差异较小，清香风格组内风格差异较大。

表4 15 种市售卷烟的检测结果Tab.4 Detection results of 15 commercial cigarette samples

表4 （续）

表4 （续）

表5 8 种具有显著性差异的酯类香味成分的P 值及F 值Tab.5 P and F values of 8 esters with significant differences

图7 8 种具有显著性差异的酯类香味成分的PLS-DA 分析结果Fig.7 Results of PLS-DA analysis of 8 esters with significant differences

3 结论

①通过优化的QuEChERS 前处理方法结合GC-MS/MS 技术建立了检测烟草中重要酯类香味成分的方法，能满足烟草样品中57 种对感官品质有影响的酯类香味成分检测需求。②对于实际样品检测，可以较好地区分不同风格的卷烟样品，证明所建立的方法具有良好的实用性。③与传统方法相比，本方法在靶标物数量、灵敏度和精密度方面显著提高，具有简便、高效、高通量等优点。