应用RAPD分析方法评估春黑麦品种的遗传多样性

李姗姗

摘 要：黑麦是小麦的近缘物种，可改良小麦所需的许多目标性状，是丰富小麦遗传变异、选育优良新品种的重要基因资源。该研究利用RAPD技术评估11个来自不同国家春黑麦品种的遗传多样性，为育种者选择亲本提供帮助，且通过实验进一步了解黑麦的起源历史。

关键词：黑麦;RAPD;遗传多样性;遗传距离

中图分类号 S512.1文献标识码 A文章编号 1007-7731（2019）22-0008-04

Genetic Diversity of Spring Rye Cultivars Evaluated by RAPD Analysis

Li Shanshan

（Anhui Institute of Quality and Standardization，Hefei 230051，China）

Abstract：Rye is the related species of wheat，it has many of the required target traits of improving wheat. It is the important genetic resources of riching wheat genetic variation and breeding new varieties. In this study，RAPD analysis was used to evaluate the genetic diversity of 11 spring rye varieties from different countries. The result from the current study provide help for breeders in the selection of parents for breeding purpose. And the origin of the rye was also showed in the study.

Key words：Rye;RAPD;Genetic diversity;Genetic distance

1 引言

在東欧和北欧，普通黑麦（Secale cereale L ssp. cereal）是一种重要的作物，由于其对低温和含有高浓度铝元素的土壤有着极佳的耐受性，相对于其他温带谷物而言，有其自身的优势。在欧洲，黑麦是第2大重要的谷物，其在作为小麦（Triticum aestivum L.）外来基因源方面发挥着重要的作用。分子水平上遗传多样性，有可能为杂交育种选择合适的亲本提供帮助。为此，本研究调查了来自欧洲不同国家春黑麦（S.cereale ssp. cereale）品种的遗传多样性，旨在了解黑麦在世界上的起源历史[1-3]，为育种亲本选择提供帮助。

2 材料与方法

2.1 实验材料 采用11个来自波兰科学院科学植物园的春黑麦品种，均生长在温室里。11个春黑麦品种分别为：（1）Arens Abruzzi–USA、（2）Bojko-Poland、（3）Gator-USA、（4）Gazelle-Canada、（5）Karlshulder-Germany、（6）Petka-Germany、（7）Petkuser Sommer-Germany、（8）Priaborschi-Romania、（9）Profili Spring-USA、（10）Somro Petkus-Germany、（11）Strzekencinskie-Poland。

2.2 实验试剂 （1）Genomic Mini AX plant cat .no.050-60（来自波兰A&A生物技术中心）、（2）无核酸酶的水（来自于Thermo Scientic）、（3）Taq酶++ Master Mix （2x） （来自于Thermo Scientic）、（4）引物（来自Operon Technologies Inc公司）、5TBE buffer的成分—10.8g Tris base—5.5g Boric acid;—0.744g 0.5MEDTA;—1000mL去离子水。

2.3 实验方法

2.3.1 基因组DNA的提取 从2个月大的春黑麦品种植株上选取最嫩的叶片，提取DNA，这些春黑麦品种全部生长在温室中。使用Genomic Mini AX plant cat .no.050-60方法进行DNA的抽提。DNA的提取步骤如下：（1）放置大约100mg的幼叶至1.5mL的eppendorf管中，并加入0.9mL的LS裂解悬浮液和20μL的蛋白酶溶液。（2）混合试管中的物质，并在50℃下培养30min，不时反向颠倒试管。（3）温育样品15s然后在1000～1400转速下旋转5min。（4）在样品离心过程中，加入0.8mL的K1平衡液平衡色谱柱。（5）样品离心后，上清转移到1个平衡柱，并允许它由重力流动。（6）添加1.5mL的K2洗涤液洗涤平衡柱，洗涤液由于重力通过整个溶液。（7）重复洗涤步骤（操作方法同第6步骤）。（8）往平衡柱中添加0.25mL的K3洗涤液，并使洗涤液通过平衡柱。（9）将圆柱转移到1个新的2mL的沉淀管中，并通过添加1mL的K3洗涤液洗脱DNA。（10）加入0.8mL的PM沉淀液到DNA溶液中并将其混合。通过颠倒试管混合整个样品几分钟，然后在12000转速下旋转样品10min。（11）小心弃去上清液，添加0.5mL的70%的乙醇到沉淀管，混合样品，并在12000转速下旋转样品3min。（12）小心弃去上清液，并干燥含DNA的颗粒5min，将试管倒过来干燥。（13）如果有一些酒精小点滴沾在管壁上，用无菌棉签去除。

2.3.2 RAPD-PCR扩增 用12.5μL的样品进行聚合酶链式反应（PCR）[4]。其中表1为每一个RAPD-PCR扩增样品混合物的成分;表2为实验所用的引物及其序列，所用14个引物是由Operon Technologies Inc.公司测试的;表3为PCR反应的热条件和时间。

2.3.3 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳步骤如下：

（1）使用的化学物品是1500mg的琼脂糖，100mL稀释1倍的TBE缓冲液和1μL的EB。首先，用电子天平称1500mg的琼脂糖，然后将其放入到一烧杯中，再加入100mL的TBE进入烧杯，接着将瓶口封住，最后放到微波炉中将其沸腾（600W电力下运行2min）。将烧杯从微波炉中拿出后再放入1μL的EB，然后将烧杯内的液体倒入到电泳槽中。

（2）用蓝色试剂进行DNA的染色，往所有装有DNA的eppendorf试管里添加1μL的溴酚蓝，所以最后在每一个试管里都有13.5μL的溶液，然后准备DNA Ladder，往一个空的eppendorf试管里放入10.5μL的水，再加入2μL的DNA Ladder（O′ RangeRule 100bp DNA Ladder），最后加入1μL的溴酚蓝，混匀。

（3）最后将所有混合物都加到琼脂糖凝胶孔中进行电泳。且在琼脂糖凝胶中加样的顺序如下：Arens Abruzzi，Bojko，Gator，Gazelle，Karlshulder，Petka，Petkuser Sommer，Priaborshi，Profili Spring，Somro Petkus，Strzencinskie这11个品种的DNA样品以及DNA Ladder （O′RangeRule100bp DNA Ladder，它有11条带，大小分别是1500bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp）。接着添加TBE懸浮液进入电泳槽中，然后70V电压下2h。最后在紫外透射灯上观察并记录。每1个样品DNA都会进行3～4次的RAPD扩增，最后选取扩增效果最好的那一次记录。

2.3.4 数据分析 为了计算遗传相似性（GSab），采用的是Nei和Li（1979）方法。计算公式为：

GSab=2Nab/（Na+Nb）

式中：Nab等位基因数在对象a和对象b上;

Na等位基因数在对象a上;

Nb等位基因在对象b上。

基于所计算出的遗传相似系数（GSab），依据非加权组平均法（UPGMA）对春黑麦品种进行聚类，聚类结果以树状图的形式表达。

遗传距离计算公式为：GD=1-GSab

3 结果与分析

3.1 RAPD扩增 在本实验中，DNA是从11个春黑麦品种提取的。使用14个不同的引物利用PCR仪扩增每个品种的DNA，14个引物分别是OPA-04，OPA-09，OPA-07，OPA-12，OPC-18，OPD-16，OPB-10，OPB-17，OPH-13，OPH-20，OPI-12，OPF-04，OPF-08，OPF-12。但是在本实验中，只发现OPA-04，OPA-07，OPA-09，OPB-10，OPB-17，OPH-13，OPH-20，OPI-12等8个引物能得出好的结果，使用这8个引物能得出大量的扩增产物，共产生86条扩增带（图1和图2）[5-6]。

3.2 遗传距离 为了得到11个春黑麦品种的遗传距离，UPGMA聚类图以1个可视性图片显示出了它们之间的遗传关系（表4和图3）。RAPD分析基础上的聚类分析图显示了品种Priaborshi和品种Profili Spring之间的遗传距离系数（GDC：Genetic Distance Coefficient）是1-0.769=0.231，表明2个品种之间的遗传差异较小。品种Gazelle和Petkuser Sommer之间的GDC是1-0.797=0.203，表明2个品种之间的遗传差异性也很小。品种Arens Abruzzi和Petka之间的GDC是1-0.775=0.225，品种Somro Petkus、Priaborshi、Profili Spring之间的GDC是1-0.73=0.27，品种Karlshulder、Arens Abruzzi、Petka之间的GDC是1-0.732=0.268，品种Gazelle、Petkuser Sommer、Karlshulder、Arens Abruzzr、Petka之间的GDC是1-0.694=0.306，品种Somro Petkus、Priaborshi、Profili Spring、Gazelle、Petkuser Sommer、Karlshuder、Arens Abruzzi和品种Petka之间的GDC是1-0.689=0.321，品种Strzekencinskie–Poland、Somro Petkus、Priaborshi、Profili Spring、Gazelle、Petkuser Sommer、Karlshuder、Arens Abruzzi和品种Petka之间的GDC是1-0.667=0.332，品种Gator、Strzekencinskie–Poland、Somro Petkus、Priaborshi、Profili Spring、Gazelle、Petkuser Sommer、Karlshuder、Arens Abruzzi和品种Petka之间的GDC是1-0.624=0.376，11个春黑麦品种之间的遗传距离系数（GDC）是1-0.58=0.42，表明这些品种之间的遗传差异性不大。品种Priaborshi和品种Profili Spring之间的GDC是1-0.769=0.231，品种Arens Abruzzi和品种Petka之间的GDC是1-0.775=0.225，表明它们之间的亲缘很接近。从这些遗传相似系数来看，11个春黑麦品种之间的亲缘关系是非常明显的，而且最近的遗传距离出现在品种Gazelle和品种Karlshulder之间，该值是0.031，最远的遗传距离出现在品种Bojko和品种Strzekencinskie之间，该值是0.505[7-8]。

依据公式GD=1-GSab可得到所有品种之间的遗传距离值。

4 结论

本研究通过RAPD分析比较来自不同国家不同春黑麦品种的遗传多样性，结果表明：

（1）来自不同国家的11个春黑麦品种间的遗传距离系数范围在0.031～0.505。

（2）最高的遗传距离系数是0.505，出现在波兰黑麦品种Bojko和波兰黑麦品种Strzekencinskie之间;最低的遗传距离系数是0.031，出现在加拿大黑麦品种Gazelle和德国黑麦品种Karlshulder之间。来自罗马尼亚的黑麦品种Priaborschi和来自美国的黑麦品种Profili Spring之间的遗传距离系数（GDC：Genetic distance coeffiecient）是0.231，来自美国的品种Arens Abruzzi和来自德国的品种Petka之间的遗传距离系数是0.225，这意味着它们之间的亲缘关系很接近。

（3）通过实验结果可知，RAPD标记是评估黑麦遗传多样性一个可靠有效的方法。根据RAPD分子标记多态性，可以估测11个春黑麦品种之间的遗传关系。

（4）通过实验结果了解到11个春黑麦品种之间的遗传多样性，这些数据不仅可以为育种者在选择亲本上提供很大的帮助，还进一步了解到黑麦在世界上的起源历史。

参考文献

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（责编：张宏民）