温度对提取RNA质量的影响

陈 朗，吴 佳，黄国明，姜 涛，李耀东

（西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030）

在动物组织中进行RNA提取是分子生物学中的基础实验技术，而提取RNA 的质量将直接影响cDNA文库的构建、基因克隆、基因表达分析和功能基因筛选等后续结果的可靠性[1]。在提取RNA的过程中RNA的质量受到多个因素的影响[2]，温度是制约提取RNA质量的重要因素[3]。本实验采用TRIzol法[4]在不同温度（2℃、4℃和8℃）条件下提取鸡肉RNA，探究不同提取温度对RNA质量的影响。

1 材料与方法

鸡来自市场购买，静宁鸡，将鸡进行解剖，将各个组织切割成一定大小后放入研钵中，再加入液氮研磨至粉状，采集研磨好的冷冻组织到离心管，然后迅速加入1 ml Biozol Reagent, 漩涡充分震荡30 s。保证所有的凝块全部溶解。冰上静置5 min，再用2℃（高速冷冻离心机）/4℃（高速冷冻离心机）/8℃（高速冷冻离心机），12 000 rpm离心10 min，除去上层油脂，吸取中间层匀浆液转移至新的离心管中。在离心管中加入1/5体积的氯仿。盖好盖，漩涡剧烈震荡15 s，冰上静置10 min。2℃（高速冷冻离心机）/4℃（高速冷冻离心机）/8℃（高速冷冻离心机），12 000 rpm 离心15 min。溶液分为酚氯仿相、中间相和上层水相。RNA溶解在水相中。转移不超过80%的水相到一个干净的离心管，然后加入等体积的异丙醇，漩涡充分震荡15 s，在冰上静置15 min。2℃（高速冷冻离心机）/4℃（高速冷冻离心机）/8℃（高速冷冻离心机），12 000 rpm 离心10 min，离心后试管底部将出现沉淀。RNA沉淀的清洗：沿管壁轻轻加入1 ml 75%的乙醇，用手轻轻震荡离心管洗涤沉淀。在2℃（高速冷冻离心机）/4℃（高速冷冻离心机）/8℃（高速冷冻离心机），8 000 rpm 离心5 min，弃上清，尽量去除残留乙醇，这样可以减少盐离子污染。RNA沉淀的清洗：沿管壁轻轻加入1 ml 75%的乙醇，用手轻轻震荡离心管洗涤沉淀。7 500 rpm 离心5 min，弃上清，尽量去除残留乙醇，减少盐离子污染。RNA的溶解：室温晾干或真空干燥，然后加入30～50 μl DEPC 水溶解RNA，枪头吸打几次，待沉淀完全溶解。将RNA成品分成几份，放置于-80℃低温冰箱中做长期保存。

取4μl总RNA样品与2μl上样缓冲液（10×loading buffer）混合，以1×TAE为电泳缓冲液，在1%的琼脂糖凝胶上和200V电压条件下电泳30 min，结果用凝胶成像仪拍照保存。

然后对总RNA的质量进行鉴定：使用Shimadzu Corporation公司的UV-1800紫外-可见分光光度计进行260 nm和280 nm紫外光检测，取不同温度提取的总RNA各20μl，加入DEPC水稀释，混匀至1ml，以DEPC水参比，用紫外分光光度计在吸光度为260 mm和280 mm处进行测量，计算OD260 mm和OD280 mm处吸光度的比值，每个样品重复三次，取其平均值，并以经验公式[5]估算RNA浓度=40μg/μl×稀释倍数×OD260 nm。

2 结果与分析

2.1 琼脂糖凝胶电泳结果分析

RNA琼脂糖凝胶电泳的结果是判定RNA质量的重要途径，从28S、18S、5SRNA条带的带型和亮度可以判断出提取RNA的质量。在1%的琼脂糖凝胶上，3种温度所提取的RNA电泳结果如图1所示。3种不同温度提取的RNA电泳移动速率基本一致，2℃条件下所提取的总RNA条带非常暗，4℃条件下提取的总RNA条带拖带严重，无法区分5S位置上的条带，是属于DNA条带，还是5SRNA，亦或是两者的混合物。8℃条件下提取的总RNA条带清晰，无断裂、少降解，拖尾现象的发生。采用3种温度提取出的RNA中，仅有8℃条件下提取出的RNA可用于后续的实验。

图1 RNA样品的琼脂糖凝胶电泳

2.2 不同温度条件下提取RNA含量分析

使用SHIMADZU公司的UV-1800进行260 nm和280 nm紫外光检测，重复三次取平均值，得出RNA浓度检测峰图（图2），并根据结果算出260 nm/280 nm的比值和RNA浓度（表1）。当OD260/OD280的比值在1.8-2.0左右可推断出总RNA未降解，表1中，在4℃条件下②样品的OD260nm/OD280nm远大于2.0，其260nm处的吸光值较小，计算得出总RNA的浓度较低，这可能是由于RNA发生降解或存在DNA和蛋白质的残留。

图2 不同温度提取出的RNA浓度检测峰图

3 讨论

从动物组织中提取出高质量的RNA是对该动物进行研究必不可少的步骤。RNA主要存在于细胞质中，少量存在于细胞核中，细胞中的RNA可分为信使RNA、转运RNA和核糖体RNA三大类，不同组织总RNA提取实质就是将细胞裂解，释放出RNA，并通过不同方式去除蛋白、DNA等杂质，最终获得高纯RNA产物的过程。提取RNA时，使用的Trizol试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质，再通过乙醇析出DNA，异丙醇沉淀蛋白质，即可将RNA分离。

表1 不同温度提取RNA的总RNA的纯度及浓度

本实验结果表明，8℃条件下提取的RNA条带清晰完整，且无拖带现象出现，而4℃条件下提取的RNA有明显拖带现象，2℃条件下提取的RNA已降解。这可能是由于Trizol试剂中的苯酚被氧化后的产物使DNA双链相交联。温度过低，让组织细胞释放的内源核酸酶活性较低，无法将残留的DNA降解，而8℃条件下的内源核酸酶能较好的除去残留DNA，从而得到高品质的RNA。并且紫外分光光度计的结果也验证了这一结论。

综上所述，在8℃条件下提取出的RNA的质量较高。