植物精油对嗜水气单胞菌和无乳链球菌的抑菌效果

◆作者：欧阳海燕 沈兆艳 吕勇 吴世林

◆单位：广州智特奇生物科技股份有限公司

目前水产动物病害防治主要依赖抗生素、抗寄生虫药及消毒剂等化学药物，常引起细菌耐药性、环境污染及水产品中药物残留等问题。免疫防治虽是水产动物疾病控制的有效途径，但我国渔用疫苗研发及应用相对滞后，目前只有4个水产动物疫苗获国家新兽药证书，其中仅珠江水产研究所研发的草鱼出血病活疫苗和嗜水气单胞菌灭活疫苗分别于2011年和2012年被批准生产使用，可用商品化渔用疫苗数量极其有限，远不能满足水产动物疫病防治的需求。因此，水产养殖中亟需安全高效、天然无残留的饲用抗生素替代品。至今报道具有潜在应用前景的水产用抗生素替代品有中草药（Reverter等，2014）、噬菌体（Li等，2017）、卵黄免疫球蛋白（Jin 等，2013） 和植物精油（Thanigaivel等，2015）等。

植物精油又称挥发油，广泛存在于芳香植物中，现已知的植物精油超过3000种，其中约有300余种已广泛应用于食品、制药和香料等行业（Bakkali等，2008）。植物精油的高效抗菌作用已被视为潜在的饲用抗生素替代品，主要研究方向集中在畜禽方面。近来研究发现植物精油同样能有效防治水产动物细菌性疾病、水霉病和寄生虫病，且能增强鱼非特异性免疫力，提高鱼类生产性能，并在尼罗罗非鱼（Rattanchaikunsopon 等 ，2009；Rattanchaikunsopon 等 ，2010b）、蟾胡子鲇（Thomas等，2013）、金鱼（Kumar等，2012）等养殖中取得了显著成效。

本试验选取广州智特奇生物科技股份有限公司的植物精油产品“智然香”与市场上常用的抗生素抗敌素，研究比较其对嗜水气单胞菌、无乳链球菌的抑菌效果，以期为水产养殖病害防治提供参考。

1 试验设计与方法

1.1 试验材料

抗菌剂：广州智特奇生物科技股份有限公司的植物精油产品（智然香：植物精油总量≥3.5%，其中香芹酚≥2.3%，百里香酚≥1.2%），市场上购买的抗敌素。

供试菌株：嗜水气单胞菌、无乳链球菌，购自广东省微生物研究所菌种保藏中心。

1.2 试验仪器

恒温恒湿箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；SW-CJ-IG型单人净化工作台，苏州净化设备有限公司；DHG-924OA电热恒温鼓风干燥箱，上海齐欣科学仪器有限公司；不锈钢手提式蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；FA2004电子天平（感量0.0001 g），上海舜宇恒平科学仪器有限公司；酒精灯、培养皿、试管、移液枪、接种环等。

1.3 培养基

无乳链球菌：血平板（蛋白胨 10 g，牛肉粉 3 g，氯化钠 5 g，脱纤维羊血50 mL，琼脂15 g），嗜水气单胞菌：LB琼脂（蛋白胨10 g，牛肉膏粉 3 g，氯化钠 5 g，琼脂15 g）溶于1000 mL水中，121℃灭菌20 min，冷却待用。

1.4 培养基的处理

在超净台内将灭菌后冷却至60℃左右的培养基倒入灭菌好的培养皿，每个平皿5 mL，加入智然香、抗敌素，嗜水气单胞菌培养基中智然香的浓度为1.7%、2%、2.3%、2.6%，抗敌素的浓度为0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、0.1%；无乳链球菌培养基智然香的浓度为 3.4%、3.7%、4%、4.3%、4.6%，抗敌素的浓度为0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%，混合均匀，冷却凝固备用。

1.5 菌悬液的配制

从经过活化的菌体斜面上挑取一环菌体接种至相应的液体培养基中，放入恒温振荡培养箱培养至对数生长期。分别吸取以上培养时间的供试菌液0.5 mL，加入无菌水稀释到105～106cfu/mL，4℃保存待用。

1.6 菌液接种

每个平皿加入25μL嗜水气单胞菌、无乳链球菌菌液，利用涂布棒将菌液涂布均匀，放入培养箱37℃培养并观察菌体的生长情况，细菌生长完全被抑制时所对应最低药物浓度即为MIC。继续培养24 h，观察菌体的生长情况，无细菌生长的最低样品浓度即为MBC值。

表1 智然香对嗜水气单胞菌的最低抑菌浓度测定结果

表2 抗敌素对嗜水气单胞菌的最低抑菌浓度测定结果

表3 智然香对无乳链球菌的最低抑菌浓度测定结果

表4 抗敌素对无乳链球菌的最低抑菌浓度测定结果

2 结果与分析

2.1 智然香、抗敌素对嗜水气单胞菌的抑菌效果

智然香、抗敌素对嗜水气单胞菌的抑菌效果如表1、表2所示，“+”代表有细菌生长，“－”代表完全无细菌生长。由表1可知，智然香浓度为1.7%时有细菌生长，2%～2.6%均无细菌生长，即智然香对嗜水气单胞菌的最低抑菌浓度为2%；抗敌素浓度为0.6%时有细菌生长，0.7%～1%时均无细菌生长，即抗敌素对嗜水气单胞菌的最低抑菌浓度为0.7%。

2.2 智然香、抗敌素对无乳链球菌的抑菌效果

智然香、抗敌素对无乳链球菌的抑菌效果如表3、表4所示。由表3可知，智然香浓度为3.4%～4.3%均有细菌生长，而4.6%平皿中没有细菌生长，即智然香对无乳链球菌的最低抑菌浓度为4.6%。由表4可知抗敌素浓度为0.6%～0.9%均有细菌生长，浓度为1%时没有细菌生长，抗敌素对无乳链球菌的最低抑菌浓度为1%。

3 讨论

目前水产养殖病害损失比例中鱼类占很大部分，主要以细菌性疾病为主，并且大多数是由嗜水气单胞菌引起的鱼类细菌性出血病。嗜水气单胞菌是一种革兰氏阴性短杆菌，普遍存在于淡水、污水、淤泥、土壤和人类粪便中，对水产动物、畜禽和人类均有致病性，可引起多种水产动物的败血症和人类腹泻，往往给淡水养殖业造成惨重的经济损失（储卫华，2001）。无乳链球菌又称B簇链球菌，是革兰氏阳性球菌，能引起新生儿脑膜炎、败血症、肺炎，以及奶牛乳腺炎，可感染多种水生动物（Wang等，2017）。近年来，随着水产养殖业的发展，无乳链球菌已对多种海、淡水鱼类造成严重危害（刘礼辉等，2015；Barony 等，2017）。无乳链球菌最敏感的宿主是罗非鱼，在夏、秋季易爆发，该病传染性强，幼鱼与成鱼的发病率达10%～30%，死亡率25%～80%（张新艳，2008），给罗非鱼养殖业造成了极大的经济损失。鱼类爆发细菌性疾病时，由于缺乏高效疫苗，抗菌药物仍然是养殖基层防控该病的首选，长期用药和滥用药会加快细菌对某些抗生素产生不同程度的耐药性，这也给水产动物病害防控带来挑战，迫切需要研发新型抗生素替代品来防治水产养殖动物细菌性疾病。

植物精油因具有广谱抗菌性已受到科学家的热切关注，其不仅可以有效防止饲料保存过程中青霉菌、曲霉菌等霉菌的滋生，还能调控机体内大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等有害菌的增长，目前植物精油已广泛应用于水产动物疾病防治中。Lee等（2009）发现，丁香精油对海鱼弧菌、迟钝爱德华氏菌和嗜水气单胞菌的最低抑菌质量浓度为 0.015～0.062μg/mL，但该研究未通过体内试验验证。体内试验证实，对罗非鱼腹腔注射迟缓爱德华氏菌攻毒，日粮中添加200 mg/kg香芹酚，罗非鱼累积死亡率由50%降至30%；而饲喂香芹酚与对伞花烃混合精油（各为200 mg/kg）罗非鱼死亡率则降至0%（Rattanchaikunsopon等，2010a）。同样的，用添加茶树油的饲料饲喂银鲶鱼发现，50μL/L的茶树油可延长并治疗感染嗜水气单胞菌鱼的寿命，治愈率达 88%（Dos Santos等，2017）。另外 Baldissera等（2017）利用茶树油抵制嗜水气单胞菌的研究发现，茶树油可通过影响胆碱能系统，抑制炎症的方式来抵制嗜水气单胞菌的感染，同时产生抗氧化酶，如CAT和超氧化物歧化酶，以清除过量的自由基，减轻细菌引起的肝损伤。而植物精油对无乳链球菌的抑菌效果尚未有相关研究报道。

本实验比较了植物精油产品“智然香”和抗敌素对嗜水气单胞菌和无乳链球菌的抑菌效果，结果表明，智然香和抗敌素对嗜水气单胞菌的最低抑菌浓度分别为为2%和0.7%，对无乳链球菌的最低抑菌浓度分别为4.6%和1%，表明智然香对嗜水气单胞菌的抑菌效果好于无乳链球菌。虽然智然香对嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度高于抗敌素，但是智然香依然可以以较小的浓度起到完全抑制嗜水气单胞菌生长的作用，证明智然香对嗜水气单胞菌具有良好的抗菌效果，但体外抗菌实验只能说明所试智然香与细菌直接接触所产生的影响，而对被细菌感染患病的动物的治疗效果，仍需进行动物体内实验才能证实。

4 结论

植物精油产品“智然香”和抗敌素对嗜水气单胞菌的最低抑菌浓度分别为2%和0.7%，对无乳链球菌的最低抑菌浓度分别为4.6%和1%。植物精油产品“智然香”可以以较小浓度抑制嗜水气单胞菌的生长，可用于嗜水气单胞菌感染引起的水生动物疾病预防和控制。