猪圆环病毒病抗体高敏荧光免疫层析快检试剂盒的研制

王泽洲，吴俊清，章健，陈弟诗，张毅，贺冬梅

(1.四川省动物疫病预防控制中心，四川 成都 610041；2.成都微瑞生物科技有限公司，四川 成都 611731）

猪圆环病毒病（PCV-2）是由圆环病毒2型引起的一类免疫抑制性传染病，该病伴随着蓝耳病、非典型猪瘟等并发或继发，给我国养猪业造成了巨大的经济损失［1-2］。目前对该病的诊断主要采用PCR、间接免疫荧光试验（IFA）和免疫组织化学染色法（IHC）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、胶体金技术等方法［3-5］，这些方法在生产实际中都不同程度地受到条件制约。为达到在基层和养殖场实现快速即时检测，本研究应用镧系元素作荧光标记物，研制了一种既具有金标层析技术简单方便、快捷，又具有ELISA 准确、特异、敏感的猪圆环病毒抗体高敏荧光免疫层析快速检测试剂盒（PCV-2-LFICA）。

1 材料与方法

1.1 材料 PCV-2 表达蛋白抗原、兔抗鸡IgY 抗体、鸡IgY抗体，镧系荧光纳米微球和Wellray®WR-1608 荧光仪；吸水纸、样品垫、硝酸纤维素膜，1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC），N-羟基琥珀酰亚胺，切条机、点膜和喷金膜机，其他试剂均为国产分析纯。猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸道综合征病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、猪乙型脑炎病毒（JEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）的阳性血清，猪圆环病毒II型抗体ELISA检测试剂盒。

此外，制备包被膜、抗原标记微球、夹心法建立等均参照说明书或按相关要求操作。

1.2 荧光免疫层析试纸条的组装 在湿度小于30%，温度20～25 ℃的环境下，把吸水纸、标记物垫和样品垫按顺序粘贴在聚氯乙烯底板上形成微反应体系，然后将其切割成0.5 cm宽，即成试纸条，将试纸条装入卡壳中制成检测卡，装入铝箔袋封存备用。

1.3 特异性试验 以建立的判断标准（标准曲线）与CSFV、PRRSV、PRV、PPV、JEV、PEDV、TGEV阳性血清进行猪圆环病毒病抗体镧系荧光免疫层析检测，同时设猪圆环病毒抗体阳性、阴性对照，旨在确定该检测方法是否发生交叉反应。

1.4 敏感性试验 将PCV-2 标准阳性血清进行1∶4、1∶16、1∶64、1∶256、1∶1 024、1∶4 096、1∶16 384倍比稀释，每个稀释度平行做4个重复，用组装的PCV-2-LFICA试剂盒检测，将结果换算成S/P值，判断抗体检出效价。

1.5 重复性试验

1.5.1 批内重复性试验 在相同条件下选取12份PCV-2抗体水平不同的血清样本，每份样本平行做8个重复，用组装的PCV-2-LFICA试剂盒检测（批号为20170626），然后对检测结果进行统计学分析。

1.5.2 批间重复性试验 在相同条件下选取12份PCV-2 抗体水平不同的血清，分别用4 批PCV-2-LFICA试剂盒检测（批号分别为20170626、20170718、20171011、20171219），然后对检测结果进行统计学分析。

1.6 比较试验 分别用组装的PCV-2-LFICA试剂盒和猪圆环病毒2型抗体ELISA试剂盒同时检测同一批临床样品200 份，比较两种方法检测结果的符合率。

1.7 试剂盒的组装及保存期试验 PCV-2-LFICA 试剂盒由荧光检测仪、检测卡、连接线组成。试剂盒置4 ℃保存，于保存后60、120、180、240、300、360、420、480 d按照PCV-2-LFICA各个优化条件，对PCV-2阳性和阴性参考血清进行检测，并对结果进行统计学分析。

1.8 应用试验 用PCV-2-LFICA试剂盒对收集自四川省内各地的2 372 份血清样本进行检测，了解PCV-2血清抗体阳性率。

2 结果

2.1 测定条件的选择

2.1.1 标记量的选择 把标记好的质量比（抗原/微球）不同的荧光微球稀释相同倍数，组装成检测卡，在检测卡加样孔中分别加入80 μL 参考样本，室温下层析15 min，检测，考察并验证不同标记量对标记结果的影响。结果表明，随标记抗原浓度的增加，各浓度点的结合率呈现先增后降的趋势，在抗原/微球的质量比为1∶25 时有最大值。因此，选择标记比例为1∶25的免疫微球进行后续实验。

2.1.2 加样量的选择 在其他条件一致的情况下，考察并验证样本不同稀释倍数对检测结果的影响。在检测卡加样孔里分别加入稀释10、20、30、40、50、60、70 倍的参考样本，室温下反应15min后检测。结果表明，随稀释倍数的增加，各浓度点的结合率均减小。当样本稀释倍数为40倍时，继续降低稀释倍数，结合率增加不明显，免疫反应基本饱和。因此，后续实验选择样本稀释倍数40倍为加样量。

2.1.3 检测时间的选择 在检测卡加样孔中加入80 μL参考样本，室温下反应，分别在5、10、15、20、25、30 min 时检测，考察不同检测时间对结果的影响。结果表明，随着检测时间的延长，各浓度点的结合率基本呈现增加的趋势，试纸静置15 min 检测时即能达到较高的结合率，而随着检测时间的增加，各浓度点的结合率不再发生较大的变化，趋于平稳，说明在15 min 时试纸条上的双抗原夹心吸附基本达到饱和。因此，本着快速简便的原则，选择检测时间为加样后15 min。

2.2 检测结果的判读 加样后，由于液体向前移动，先后与包被在T 线和C 线上的抗原形成复合物，这时试纸条经荧光检测设备扫描显示出2 条荧光带（图1）。C线荧光扫描值基本一致，T线值随加样中抗体浓度的增加而升高。相应的检测结果以浓度为横坐标，荧光值信号为纵坐标，经对数函数数据处理程序拟合得到标准曲线（图2）。当样本为阴性时，PCV-2抗体浓度很低，T线荧光值很低或完全检测不到；当样本为阳性时，PCV-2 抗体浓度越高，T 线荧光值也越高。无论结果是阳性还是阴性，C线总能显示荧光，如果C线没有荧光显现，无论T 线有无，结果均判为无效。

图1 荧光微球免疫层检技术检测PCV-2抗体的扫描图谱

图2 荧光微球免疫层析技术检测PCV-2抗体的标准曲线

2.3 特异性试验 本次用PCV-2 蛋白抗原和全病毒建立的PCV-2-LFICA 试剂盒检测7 种常见猪病的阳性血清，得到的荧光比值均低于0.40（见表1），呈阴性反应。表明该方法与7 种常见猪病的阳性血清不发生交叉反应，显示出很好的特异性。

2.4 敏感性试验 选取3 份猪圆环病毒2 型抗体强阳性血清进行1∶4、1∶16、1∶64、1∶256、1∶1 024、1∶4 096、1∶16 384 倍比稀释，然后做敏感性比对试验。分别用高敏荧光免疫分析法与酶联免疫吸附试验检测同一份血清，得出PCV-2-LFICA 试剂盒的检测滴度为1∶64，而ELISA 为1∶4，前者比 后 者 高1～2 个 滴度。表 明 PCV-2-LFICA 试剂盒的敏感性较好。

2.5 重复性试验 批内重复性试验的变异系数小于10%（表2），批间重复性试验的变异系数也小于10%（表3）。表明PCV-2-LFICA试剂盒具有良好的重复性。

2.6 比较试验 用PCV-2-LFICA试剂盒检测临床样品200份，得出177份阳性，20份阴性，3份可疑；用酶联免疫吸附试验检测200份临床样品，得出33 份阴性，167 份阳性。两种检测方法的总符合率为91%（表4）。

2.7 保存期试验 如表5所示，PCV-2-LFICA试剂盒在保存480 d后检测阳性血清、阴性血清，其变异系数均小于10%，说明该诊断试剂盒在保存12个月后仍然稳定有效，进一步的稳定性试验还在进行中。

表1 特异性试验结果

表2 批内重复性试验结果

表3 批间重复性试验结果

表4 比较试验结果

表5 保存期试验结果

2.8 现场应用试验 使用本次研制的PCV-2-LFICA 试剂盒检测收集自四川省内各地的2 372份血清样本，结果检出血清抗体阳性1 822份，阳性率为76.8%。

3 结论与分析

3.1 镧系荧光免疫层析方法（LFICA）是在时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）基础上建立起来的一种超微量快速免疫检测技术，它集合了酶标记技术、放射标记技术和同位素标记技术的优点，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、无污染，且测定范围宽，试剂盒寿命长，操作简单和无放射性等优点。在人医学界已有文献报道，在兽医学领域才起步，需要研究的内容和范围还很多［6］。与国内ELISA 试剂盒检测结果的符合率和敏感性都在90%以上，说明该方法完全可以用于PCV-2免疫抗体的检测。

3.2 猪圆环病毒病是一种免疫抑制性疾病，本身可以引起猪群发病和死亡，同时也可以潜伏在机体中，当环境条件改变或有蓝耳病、猪瘟、副猪嗜血杆菌病发生的时候，出现继发或并发感染，使猪群发病率和死亡率增加，给养猪业造成巨大的经济损失［7-10］。在圆环病毒病抗体的常用检测方法中，ELISA是目前应用最广、发展最快的免疫检测方法，也是当前检测猪圆环病毒病抗体的主要方法，该法具有敏感性高、特异性强、操作简单、检测相对快速、检查微量、无辐射、高通量等优点，但需要比较完备的实验设备，操作人员需要具有一定的专业技术和经验，检测一批样品的整个流程至少需要2～4 h，对于基层兽医站和中小养殖场不适用。间接免疫荧光试验(IFA)和免疫组织化学染色法(IHC)、PCR 等方法，也都需要专门的实验室、仪器设备和专业技术人员，并且成本较高。胶体金免疫层析法（GICA）是近年来发展起来的一种快速检测方法，该方法操作简单，使用方便，不需要特殊仪器设备，肉眼直接观察和判定结果，全程只需要几分钟，但敏感性较差、重复性不高，产品质量参差不齐，漏检率和误诊率较高。本研究建立的PCV-2-LFICA 法，既具有胶体金免疫层析法简单方便、适于基层等优点，又具有ELISA敏感、特异、微量等优点，检测时间从2～4 h缩短到十多分钟，检测不需要具有经验的专业人员，检测设备小巧便于携带，尤其适用于基层兽医部门和养殖场的技术人员。