石斛西洋参景天姜胶囊安全性及缓解体力疲劳功能研究

朱雪峰 ，严 婷 ，李世芬 ，胡 奇 ， 张成香

（1.南京医科大学公共卫生学院，江苏南京 211166；2.江苏省医药农药兽药安全性评价与研究中心，江苏南京 211166）

铁皮石斛属兰科石斛属植物，新鲜或干燥茎，为药食两用[1]，具有很好的抗衰老、抗肿瘤、抗氧化、提高免疫力的功效，并且可用于肿瘤、糖尿病、慢性咽炎、胃炎、机体免疫下降等的辅助治疗[2-4]。西洋参为五加科植物，根味苦、微甘、性寒，为珍贵药材[5]，现代研究表明，西洋参含有多种人参皂苷、维生素及微量元素等生理活性物质，具有增强抗疲劳能力、耐高温能力、抗肿瘤作用、降血脂作用、抗氧化作用、免疫调节作用、改善老年高血压患者的低舒张压情况等功效[6-9]。红景天为景天科红景天属草本或亚灌木植物[10]，具有增强人体免疫力、抗衰老、抗辐射、保护心脑血管等功效[11-13]。干姜为姜科植物姜的干燥根茎，是常用的药食同源中药材，化学成分主要包括挥发油和姜辣素类成分，具有极好的药用价值。目前为止，对铁皮石斛、西洋参、红景天和干姜的单一组分或2种组分联合的研究报道较多[1-12]，但未见对这4种药材配伍混合物的研究报道，试验以这4味药材提取物和辅料按照一定的工艺混合制成的胶囊为受试物进行安全性毒理学和功能研究，以期为石斛西洋参景天姜胶囊口服的安全性和功能性提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 受试物

石斛西洋参景天姜胶囊，该胶囊内容物主要包括铁皮石斛、西洋参、红景天、干姜提取物及辅料。于阴凉避光处保存，供试验备用。人体推荐摄入量为2.4 g/人/日。

1.1.2 试验动物及饲料

急毒试验用动物为健康成年SPF级ICR小鼠20只，雌雄各半，南京医科大学医药实验动物中心提供；微核试验和小鼠精子畸形试验选用清洁级ICR健康小鼠，扬州大学比较医学中心提供；30 d喂养试验用动物为SPF级健康离乳SD大鼠80只、功能试验用动物为SPF级CI/F1代健康雄性小鼠160只，雌雄各半，上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，试验动物在屏障系统中饲养；辐照鼠用灭菌饲料，江苏省协同医药生物工程有限责任公司提供。

1.1.3 仪器、菌株和试剂

T-1000型电子天平、JJ-100型电子天平、离心机、OLYMPUS型显微镜、日立7100型全自动生化分析仪、SIEMENS ADVIA 2120i型血液分析仪、离心机、水浴锅、多功能酶标仪、BIOSEN C＿Line GP+葡萄糖/乳酸分析仪、游泳箱（大小约50 cm×50 cm×40 cm）。鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株TA97、TA98、TA100、TA102 来源于 Molecular Toxicology，Inc.；S-9来源于江苏齐氏生物科技有限公司；血浆尿素试剂盒、肝糖原试剂盒，南京建成生物工程研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 急性经口毒性试验

用最大耐受量法开展小鼠急性毒性试验，设计剂量为 15 000 mg/kg·bw。

1.2.2 Ames试验方法

采用标准平板掺入法，选鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株TA97，TA98，TA100，TA102，经鉴定合格后开展试验。在加与不加S-9的情况下以5 000，1 000，200，40，8 μg/皿剂量进行试验，每个剂量3个平皿。同时设阳性、阴性对照组。以上试验过程重复1次。

1.2.3 小鼠骨髓细胞微核试验

25～30 g的ICR清洁级小鼠50只，雌雄各半，按体重随机分为5个组，每组10只。设1 250，2 500，5 000 mg/kg·bw 3个剂量组、阴性对照组（无菌水，20 mL/kg·bw灌胃） 和阳性对照组（环磷酰胺，40 mg/kg·bw腹腔注射）。采用30 h给受试物法，2次给样间隔24 h，第2次给样6 h后处死动物，取小鼠胸骨骨髓常规制片、镜检，计数1 000个骨髓嗜多染红细胞（PCE） /每支动物，计算微核发生率。计数200个嗜多染红细胞时所观察到的成熟红细胞数（NCE） /每只动物，计算PCE/NCE。

1.2.4 小鼠精子畸形试验

ICR清洁级雄性小鼠25只，分为5组，每组5 只。设 1 250，2 500，5 000 mg/kg·bw 3 个剂量组、阴性对照组（无菌水，20 mL/kg·bw灌胃） 和阳性对照组（环磷酰胺，40 mg/kg·bw腹腔注射）。给样每天1次，连续5 d。于第1次给样后的第35天处死动物，取两侧附睾精子滤液制片、镜检。每只动物计数1 000个精子（结构完整），计算精子畸形发生率。

1.2.5 反复染毒试验方法

SPF级健康离乳SD大鼠80只，雌雄各40只，分为4组，每组20只。按人体推荐剂量的30，65，100 倍设 3 个剂量组 （1.2，2.6，4.0 g/kg·bw/d），另设一个空白对照组0 g/kg·bw/d，连续给样30 d。每周测1次动物体重和2次食物摄入量，计算食物利用率。30 d后，隔夜禁食，麻醉，取血测其血液学指标和血液生化指标，摘取肝、肾、脾、睾丸和卵巢称重，计算脏体比。选取对照组和高剂量组肝、脾、肾、胃、十二指肠、睾丸和卵巢制作病理切片进行组织病理学检查。

1.2.6 缓解体力疲劳功能试验方法

以0.20，0.40，1.20 g/kg·bw/d 3个剂量经口给予小鼠1个月，测小鼠的负重游泳时间、血浆尿素水平、肝糖原储备量及血乳酸值。若负重游泳试验结果阳性，且血乳酸、血浆尿素、肝糖原3项生化指标中任2项指标阳性，即可判定该受试样品具有缓解体力疲劳作用。

（1） 负重游泳时间。最后一次给小鼠受试物30 min后，置于游泳箱中游泳，水深约35 cm，水温25±1℃，鼠尾根部负荷5%体重的铅丝。记录小鼠自游泳开始至死亡的时间，作为小鼠负重游泳时间。末次给小鼠受试物30 min后，在温度为30℃的水中不负重游泳90 min，休息60 min后立即眼眶采血。血液离心后，吸取20 μL血浆，用二乙酰一肟法测定血浆尿素值。

（2） 血浆尿素水平。最后一次给动物受试物30 min后，处死取肝脏，称取75 mg，加碱溶液0.225 mL，煮沸20 min，配成1%肝匀浆液，取1%肝匀浆液0.1 mL，加2 mL蒽酮试剂，煮沸5 min，冷却后于波长620 nm处比色测定，计算肝糖原含量。

（3） 肝糖原储备量及血乳酸值。末次给动物受试物30 min后眼眶静脉采血。不负重游泳（水温30℃）10 min后停止，立即眼眶静脉采血，休息20 min后再采血，测定动物血乳酸含量。葡萄糖/乳酸分析仪测定乳酸方法：取血10 μL并转移到反应试管中，盖紧盖子振荡混匀，从分析仪上读数。

血乳酸曲线下面积用下式表示：

血乳酸曲线下面积＝1/2×(游泳前血乳酸值＋游泳后0 min的血乳酸值)×10+1/2×（游泳后0 min的血乳酸值+游泳后休息20 min的血乳酸值）×20.

1.2.7 统计学分析

微核试验结果采用Poisson分布U检验进行统计处理，小鼠精子畸形试验结果采用秩和检验进行统计处理。30 d喂养试验和小鼠功能试验对各试验原始数据进行方差齐性检验，满足方差齐要求的数据资料用单因素方差分析方法中多个试验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理；对方差不齐的数据资料采用秩和检验进行统计处理。

2 结果与分析

2.1 急性经口毒性试验

动物未观察到异常，MTD大于15 000 mg/kg·bw，无毒级。

2.2 Ames试验结果

各剂量组的回变菌落数均未超过阴性对照组的2倍，受试物对鼠伤寒沙门氏菌 TA97，TA98，TA100，TA102这4株试验菌株，在加与不加S-9时，均未见有致基因突变作用。

2.3 小鼠骨髓细胞微核试验结果

小鼠骨髓细胞微核试验结果见表1。

表1 小鼠骨髓细胞微核试验结果

由表1可见，各剂量组微核率与阴性对照组比较无显著性差异 （p＞0.05）。受试物各剂量组的PCE/NCE比值与对照组的差异均在对照组20%以内，受试物对骨髓细胞增殖没有抑制作用。说明受试物对小鼠骨髓细胞（骨髓多染细胞）无诱发微核作用。

2.4小鼠精子畸形试验结果

小鼠精子畸形试验结果见表2。

表2 小鼠精子畸形试验结果

由表2可见，各剂量组精子畸形率与阴性对照组比较，无显著性差异（p＞0.05），受试物对小鼠精子畸形率未产生影响。

2.5 30 d喂养试验结果

各组大鼠未见明显异常表现和行为，未观察到中毒体征和死亡。雌、雄性大鼠各剂量组各观察点的体重、食物利用率、血液学、血生化、脏器绝对质量及相对质量与0 g/kg·bw/d组比较，均无异常。

大体解剖学检查各剂量组的肝、肾、脾、胃、十二指肠、睾丸、卵巢等未见异常改变；镜检结果显示，空白对照组和高剂量组除了各有1例轻度肝脂肪变性外，无其他异常改变。因大鼠自然群体中有一定概率的肝脂肪会发生变性，结合空白对照组和高剂量组均有1例，故试验中肝脂肪变性被判断为非受试物引起。

2.6 缓解体力疲劳功能试验

0.40，1.20 g/kg·bw/d组小鼠负重游泳时间长于0 g/kg·bw/d组；各组血浆尿素水平与0 g/kg·bw/d组比较，差异无统计学意义（p＞0.05）；而各组的肝糖原储备量高于0g/kg·bw/d组，差异有统计学意义（p＜0.05）；0.40，1.20 g/kg·bw/d 组小鼠游泳后血乳酸曲线下面积值低于0 g/kg·bw/d组，差异有统计学意义 （p＜0.05）。

表3 小鼠缓解体力疲劳功能试验结果（x±s）

3 结论

为探讨石斛西洋参景天姜胶囊的食用安全性和缓解体力疲劳功能，研究从急性经口毒性试验、30 d喂养试验、遗传毒性试验和小鼠缓解体力疲劳功能试验4个角度开展。结果表明，石斛西洋参景天姜胶囊对小鼠急性经口毒性试验的MTD大于15 000 mg/kg·bw，属无毒级。遗传毒性试验中，Ames试验、小鼠微核试验和精子畸形试验均未检测到致突变作用。30 d喂养试验以1.2，2.6，4.0 g/kg·bw/d的剂量给予大鼠30 d，各项指标均未检测到毒性作用。小鼠功能试验结果表明，石斛西洋参景天姜胶囊具有缓解体力疲劳作用。即试验条件下，石斛西洋参景天姜胶囊安全性良好，具有缓解体力疲劳功能。