红景天苷体外抗血栓作用的实验研究*

林晓坚，袁兆伟，潘彩燕，孙黔云，宛蕾**

(1.贵州医科大学 基础医学院 药理学教研室，贵州 贵阳 550025；2.贵州省中国科学院 天然产物化学重点实验室，贵州 贵阳 550014)

血小板在生理性止血过程中发挥着重要作用，当血管受到某些刺激造成血管损伤而出血时，损伤部位的激活因素即可刺激血小板，使其发生聚集、黏附成为凝块，产生初级止血的作用，随后血小板经过一系列的反应，直到血块回缩产生稳定的血栓[1-2]。临床实践表明，中药及其制剂对于抗血小板、抗血栓具有良好的效果，在治疗心血管疾病方面具有疗效可靠，副作用小等优势[3]。红景天是大花红景天(rhodiolaroseaL.)的干燥根和根茎，据药典记载，红景天具有益气活血、通脉平喘的功效，可用于治疗气虚血瘀、胸痹心痛、中风偏瘫及倦怠气喘等[4]。红景天苷(salidroside，Sal)是红景天的主要有效成分[5]，现代药理研究表明Sal具有保护心肌缺血-再灌注损伤[6]、缓解动脉粥样硬化[7]、抗肿瘤[8]、保护肾脏[9-10]、保护肝脏[11-12]及抗衰老[13]等多种药理作用，但对Sal的抗血栓作用研究较少。因此，本研究采用血块回缩实验，观察Sal体外抗血栓作用，并对血小板血栓素B2(thromboxane B2，TXB2)水平进行检测，为进一步开发Sal提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 清洁级昆明小鼠，20只，体质量25～30 g，雌雄各半，由贵州医科大学实验动物中心提供，动物合格证号SCXK(黔)2018-0001。实验前适应性喂养3 d。

1.1.2主要药物及试剂 Sal购自上海瓦兰生物科技有限公司(批号HJT20180812，纯度≥98%)，凝血酶(批号SLBV2136)、纤维蛋白原(批号SLBS4238)和前列腺素 E1(prostaglandin E1，PGE1，批号BCBQ3312V)均购自Sigma公司，盐酸替罗非班氯化钠注射液(批号171201)购自远大医药中国有限公司，裂解液(批号20180913)购自北京索莱宝科技有限公司，乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)试剂盒(批号20190327)购自南京建成生物工程研究所，TXB2试剂盒(批号201903)购自上海将来实业股份有限公司。

1.1.3仪器 BC-5130型全自动血液细胞分析仪购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，5810R型高速冷冻离心机购自德国Eppendorf公司，移液器购自德国Eppendorf公司，XS205型万分之一电子天平购自瑞士梅特勒-托利多科学仪器公司产品，RP6002K型电子天平购自常州锐品精密仪器有限公司，ELx800-MV酶标仪购自美国柏腾仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1制备小鼠洗涤血小板 实验前小鼠正常给予饲料和饮水，不给予药物干预。实验时，将小鼠麻醉(4%水合氯醛、400 mg/kg)固定后，以3.8%枸橼酸钠抗凝(抗凝剂与所取血液体积之比为1 ∶9)下腔静脉取血，置于10 mL离心管内，加入1×Tyrode Buffer(NaCl 137 mmol/L、 NaHCO313.8 mmol/L、KCl 2.5 mmol/L、NaH2PO40.36 mmol/L、HEPES 20 mmol/L、葡萄糖5.5 mmol/L)等体积稀释，同时加入终浓度为50 μg/L的PGE1；220×g 离心20 min，吸取上层富含血小板液体，转移至另一离心管(10 mL)，加入终浓度50 μg/L PGE1和1 mmol/L乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)；2 000 r/min离心10 min，弃去上清液，离心管底部为血小板团块；加入适量1×Tyrode Buffer重悬血小板，并加入终浓度50 μg/L PGE1；2 000 r/min离心10 min，弃上清液，加入适量1×Tyrode Buffer重悬血小板；血细胞分析仪检测血小板数目，用1×Tyrode Buffer调整血小板数目至2×1011个/L，室温静置30 min备用。

1.2.2LDH法检测Sal对血小板的毒性作用 将制备的洗涤血小板分为7组，即空白对照组(生理盐水)、Sal(12.5、25.0、50.0、100.0及200.0 μmol/L)5个剂量组(Sal为生理盐水配制)和裂解液裂解组。将血小板按照分组给予不同处理孵育1 h后，参照文献[14]制取待测样品，使用LDH试剂盒检测各组LDH含量，并计算LDH的相对释放量(%)=[给药组LDH(U/L)/裂解液裂解组LDH(U/L)]×100%。

1.2.3血块回缩的检测 将制备的洗涤血小板分装到2 mL离心管中，每管500 μL，分为空白对照组(5 μL生理盐水)、模型组(5 μL生理盐水)、阳性对照组(5 μL替罗非班，终浓度为0.5 mg/L)，Sal低剂量组(终浓度25 μmol/L)及Sal高剂量组(终浓度50 μmol/L)，与药物混匀后室温孵育10 min；各管加入CaCl25 μL和纤维蛋白原10 μL，使Ca2+终浓度为1 mmol/L，纤维蛋白原终浓度为400 mg/L，手指轻轻弹动，使其均匀混合；除空白对照组外，其余各管加入现配的20 000 U/L凝血酶5 μL，使其终浓度为200 U/L，上下轻轻颠倒几次使其混匀，37 ℃水浴放置，30 min时进行观察和拍照，用Image J法计算血块比率(%)=(血块面积/血块回缩前面积)×100%[15]。

1.2.4ELISA法检测血小板中TXB2的含量 分组同1.2.3，在洗涤血小板中加入不同处理孵育5 min后，加入CaCl2，使Ca2+终浓度为1 mmol/L，随后加入凝血酶(终浓度2.5×10-5U/L)聚集5 min，加入2×终止液(6 mmol/L阿司匹林，20 mmol/L EDTA)停止反应，并于冰上静置8 min，4 ℃、12 000 r/min离心10 min[16]；取上清保存于-20 ℃，样品用TXB2试剂盒检测。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 血小板LDH活性

血小板孵育1 h后，与空白对照组相比，裂解液裂解组小鼠洗涤血小板LDH活性明显较高，差异有高度统计学意义(P<0.01)，但其余各组与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；与裂解液裂解组相比，Sal各剂量组小鼠洗涤血小板LDH活性均明显较低，差异有高度统计学意义(P<0.01)，但Sal各剂量组LDH活性比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组小鼠洗涤血小板LDH活性及相对释放量Tab.1 The effects of Sal on the LDH release of washed platelets in mice

注：(1)与空白对照组相比，P<0.01；(2)与裂解液裂解组相比，P<0.01。

2.2 血小板血块回缩

水浴静置30 min后，空白对照组小鼠洗涤血小板未发生血块回缩；与空白对照组相比，模型组小鼠洗涤血小板中凝血酶能引起明显的血块回缩，血块比率显著降低，差异有高度统计学意义(P<0.01)；阳性对照组小鼠洗涤血小板中血块回缩受到显著抑制，血块比率显著大于模型组，差异有高度统计学意义(P<0.01)；Sal低、高剂量组小鼠洗涤血小板均可抑制凝血酶诱导的血块回缩，血块比率大于模型组(P<0.05或P<0.01)。见图1、表2。

注：A为空白对照组，B为模型组，C为替罗非班组，D为 Sal低剂量组，E为Sal高剂量组。图1 各组小鼠洗涤血小板的血块回缩比较Fig.1 Comparison of clot retraction of washed platelets in mice of each group

表2 各组小鼠洗涤血小板血块回缩实验中血块比例Tab.2 Comparison of clot ratio of washed platelets in mice of each group

注：(1)与空白对照组比较，P<0.01；与模型组比较，(2)P<0.05，(3)P<0.01。

2.3 血小板TXB2含量

与空白对照组相比，模型组洗涤血小板TXB2含量水平明显增大，差异有高度统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，Sal低、高剂量组和阳性对照组小鼠洗涤血小板TXB2均减少，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组小鼠洗涤血小板TXB2含量Tab.3 The effect Sal on the content of platelet TXB2

注：(1)与空白对照组比较，P<0.01；(2)与模型组比较，P<0.05。

3 讨论

血小板又称血栓细胞，是源自骨髓巨核细胞的小片细胞质，无细胞核有细胞质，是最小的血细胞，其主要功能为凝血和止血[17]。LDH是一种糖酵解酶，存在于机体所有组织细胞的胞质内，是能催化乳酸脱氢生成丙酮酸的酶，细胞受损时，受损细胞释放LDH[16]；血小板释放的LDH增加，血小板质量下降，影响血小板功能[18]。LDH释放量反映药物对血小板的毒性，其释放量大则表明对血小板产生损伤。空白对照组血小板在静置1 h后有LDH释放到胞外，但释放量明显低于LDH释放较完全的裂解液裂解组(P<0.01)，Sal低、高剂量孵育血小板后，血小板的LDH释放量较少，相较于空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)，但明显低于裂解液裂解组(P<0.01)，本实验结果表明Sal各剂量组对血小板LDH的释放量差异均无统计学意义(P>0.05)，提示Sal对血小板无明显毒性反应。血小板在纤维蛋白索上的黏着，如果血小板伪足发生收缩，被黏着的纤维蛋白索之间角度显著缩小，进而引起整个血块的收缩[19]。血小板介导的血块回缩有利于伤口的闭合，保证止血，促使形成更加稳定的栓块[20]。当机体的血小板出现功能受损或者计数过低等情况时，则血块回缩亦受到影响[19]。本研究在相同血小板计数并排除药物毒性后，进行了血块回缩实验。在37 ℃水浴30 min后，空白对照组未发生血块回缩，加了凝血酶刺激的模型组发生了明显的血块回缩，血块比率显著低于空白对照组(P<0.01)，阳性药组、Sal低剂量组和Sal高剂量组血块比率明显大于模型组(P<0.05或P<0.01)。本实验结果提示Sal对凝血酶刺激诱发的血块回缩具有显著抑制作用，这表明Sal在体外对血栓亦有抑制作用。

血小板质膜上具有二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)受体、GP Ⅱb/Ⅲa受体以及凝血酶(thrombin)受体等多种受体存在，这些受体具有相应的受体激动剂并可被其激活[21-22]。血小板在正常脉管系统中处于静息状态[23]，如果血小板发生粘附或被激动剂如ADP和凝血酶等激活，血小板随即发生一系列的后续反应，比如花生四烯酸(arachidonic acid，AA)的产生代谢，血栓素A2(Thromboxane A2,TXA2)、ADP等进行释放。血小板发生活化以后，AA生物转化为TXA2，生成的TXA2与血栓素受体(thromboxane receptors，TP)相互作用有效地增强血小板活化[24-25]。血小板由于各种原因发生激活时，存在于表面的GP Ⅱb/ⅢIa受体发生形变，这种状态下该受体具有高亲和力，可以与配体相结合。任何刺激剂激活血小板均需通过GP Ⅱb/Ⅲa受体方可与邻近血小板连接，因此GP Ⅱb/Ⅲa受体是血小板聚集和血栓形成的最终共同通路[26]。本研究选择的阳性药为替罗非班，这是一种GP Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂，结果表明在凝血酶刺激下，模型组TXB2含量明显升高(P<0.01)，相较之下，血小板经Sal孵育后再由凝血酶刺激，其生成的TXB2显著减少(P<0.05)。由于机体内TXA2可在很短的时间内降解为TXB2，因此实验中只能通过检测TXB2含量来间接反映TXA2含量，Elisa法检测结果表明Sal可以减少洗涤血小板的TXB2含量，提示Sal的抗血栓作用可能是通过减少TXA2实现的。

综上所述，Sal对血小板无明显毒性，可以明显抑制凝血酶诱导的血块回缩，此过程可能是通过减少血小板TXA2的含量发挥作用的。