结直肠癌肝转移的K-ras基因表达特点和临床病理特征分析

陈鹃 王正兵（通讯作者） 高振山 高长春 孟敏 孙树松

（南京市六合区人民医院普外科 江苏 南京 211500）

结直肠癌肝转移是晚期结肠结直肠癌最常见的远处转移之一，相关调查研究[1]发现结直肠癌患者就诊时肝转移发生率就可达15%-25%。K-ras基因作为RAS家族成员之一，被认为是肿瘤启动基因之一，与恶性肿瘤转移有密切关联。本研究通过分析结直肠癌肝转移K-ras基因突变特点及其与临床病理特征的相关性，旨在进一步说明结直肠癌肝转移基因表达特点，因为预后评估提供可靠参考依据。

1.资料和方法

1.1 临床资料

收集2017年12月－2019年11月在我院治疗的103例结直肠癌肝转移患者，入选和排除标准：①经病理学检查证实为结直肠癌肝转移；②既往无抗肿瘤治疗史；③临床资料完整；④知情同意书，自愿参与实验；⑤排除合并其他转移、心脑血管、血液疾病等其他疾病者；本研究过程经医院伦理委员会审查批准。入选患者均接受结直肠癌肝转移外科手术治疗。

1.2 研究方法

1.2.1 获取病理组织 在结直肠癌肝转移外科手术过程中，留取原发肿瘤、转移灶处组织，经甲醛固定、石蜡包埋后切5μm片。

1.2.2 提取样本组织DNA 选择癌组织超过60%的蜡块，常规脱蜡，用蛋白酶K、SDS溶液孵育24h，离心留取石蜡下液体，依据QIAamp DNA FFPF Kit试剂盒说明书提取组织DNA，洗脱DNA后，用紫外分光光度计测定DNA产物中DNA浓度，调至100μg/ml后置于-20℃保存。

1.2.3 PCR反应及SSCP分析 参照文献[2]制备PCR反应体系，提取PCR反应产物放于琼脂糖凝胶电泳45min(70V)后，用EB溶液浸泡洗脱，将凝胶板放到紫外投射仪的玻璃板上，加入变性剂上样缓冲液95℃下反应10min,，置冰盒中10min后，加聚丙烯酰胺凝胶，电泳5min(250V)后,4℃冰箱电泳3h(3W)后，银染凝胶，DNA清晰显示后,终止反应。

1.3 统计学分析

数据采用SPSS22.0统计软件进行统计分析，计数资料采用率（%）表示，进行χ2检验，计量资料采用（±s）表示，进行t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2.结果

2.1 结直肠癌肝转移K-ras基因表达特点

本研究中K-ras基因突变患者共53例，突变率为51.46%，K-ras基因突变均是单碱基点突变，突变位置为12号密码子(28例)和13密码(25例)，突变类型为GGT→GAT突变(18例)、GGT→GTT突变(15例)、GGC→GAC突变(20例)。

2.2 K-ras基因突变与临床病理特征的关系

统计学分析显示，直肠癌肝转移K-ras基因突变与K-ras基因未突变比，年龄、肿瘤分化程度、CA19-9表达，差异存在统计学意义，P＜0.05；而性别、原发肿瘤部位、转移灶大小、肿瘤分期、组织分型，P＞0.05，差异不存在统计学意义。见表。

表 K-ras基因突变与临床病理特征差异性分析

3.讨论

肝脏作为结直肠癌最主要的血行转移靶器官之一，结肠癌肝转移能够增加结直肠癌死亡风险。随着基因技术不断的发展。临床对于恶性肿瘤基因表达谱研究不断深入。目前临床已经证实多种癌基因参与了结直肠癌的转移过程。K-ras基因是临床公认的癌变启动因子之一，能够参与恶性肿瘤转移过程。K-ras基因突变时，p21蛋白结构变异，与结合GTP能力下降，GTP酶活性受到抑制，信息转导作用丧失，细胞进入无节制分裂、增殖状态，进而出现细胞癌变和转移。本研究结果显示，结直肠癌肝转移患者K-ras基因突变率超过50%，且K-ras基因突变状态与年龄、肿瘤分化程度、CA19-9表达密切相关。鉴于目前K-ras基因突变和临床病理特征关系仍存在争议[3]，本研究样本较小，仍需进行大样本研究加以证实。综上所述，结直肠癌肝转移患者多存在K-ras基因突变，K-ras基因突变可能与年龄、肿瘤分化程度、CA19-9表达有关，建议临床进一步深入研究。