白菊米多糖大孔树脂脱色工艺研究

沈 锦，刘钰梅，李 洁，潘依雯，彭小羽，陈艳丽

(盐城师范学院 药学院，江苏 盐城 224007)

白菊(White Chrysanthemum.)属菊科，多年生草本，又名甘菊、杭白菊、茶菊。白菊米是小白菊含苞待放的花蕾经科学方法加工而成，外形似半粒绿豆大，黄绿色轻圆微扁。白菊具有养肝明目、清心补肾、健脾和胃、润喉生津等功效[1]。药理研究表明，菊花活性成分具有免疫调节、抗病毒、抗氧化、降血脂等生物活性[2]。但目前对菊花化学成分的研究多集中在萜类、黄酮类、酚类等小分子化合物，对菊花多糖等大分子活性物质研究鲜有报道[3]。

传统提取工艺获得的粗多糖往往含有杂蛋白、色素等杂质，进一步纯化前需将这些杂质去除，提高多糖纯度。目前常用的多糖脱色方法有活性炭法、双氧水法、大孔树脂脱色法等[4-5]，每种脱色方法都有各自特点。

本文以多糖脱色率和保留率为评价指标，采用单因素和正交实验方法，优选出白菊米多糖最佳脱色工艺并进行大量制备。为白菊米多糖的进一步开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

白菊米，产自江苏射阳；D3520、AB-8、DM-13、D101大孔树脂、732#强酸型阳离子交换树脂，葡萄糖、半乳糖醛酸，牛血清白蛋白标准品；无水乙醇、丙酮、浓硫酸、苯酚等均为分析纯。

扣压摇摆式小型粉碎机，循环水真空泵，高速台式离心机，恒温水浴锅，紫外-可见分光光度计，移液器，旋转蒸发仪等。

1.2 实验方法

1.2.1 白菊米多糖的制备

将粉碎白菊米以料液比1∶30的比例加入无水乙醇，90℃回流脱脂2 h。脱脂后以料液比1∶30的比例加入去离子水，80℃水浴提取2.5 h，抽滤后滤渣在相同条件下二次提取并抽滤。合并两次提取滤液浓缩至200 mL，以1∶4的体积比加入无水乙醇，置入冰箱过夜。抽滤后分别以无水乙醇、丙酮洗涤脱水，60℃干燥得白菊米粗多糖。

1.2.2 脱色评价指标[6]

取1.2.1项下白菊米粗多糖，加去离子水溶解配制成5 mg/mL浓度，在200～750 nm范围内进行紫外-可见光全波长扫描。结果显示，多糖溶液在450 nm处有最大吸光度，故确定此波长为色素最大吸收波长。

(1) 脱色率的测定：取1 mL白菊米多糖溶液，加水稀释至5 mL，混匀后在450 nm处测定吸光度值，计算脱色率。

脱色率(%)=A脱色后/A脱色前× 100%

(2) 多糖保留率测定：以葡萄糖为标准品，采用苯酚-硫酸法[7]测定白菊米多糖含量。

多糖保留率(%)=M脱色前-M脱色后/M脱色前×100%

1.2.3 树脂预处理

采用95%乙醇浸泡大孔树脂24 h后，乙醇洗至无色，水洗至不再有乙醇味。732#阳离子树脂用蒸馏水浸泡24 h，水洗至溶液澄清，过滤后用1 mol/L NaOH溶液浸泡24 h，水洗至pH值到7.0左右，过滤后再用1 mol/L HCl溶液24 h浸泡，水洗至pH值达到7.0左右。

1.2.4 树脂选择

分别称取经预处理后的D3520、AB-8、DM-130、D101和732#强酸型阳离子树脂各12 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，加入30 mL白菊米多糖溶液，25℃下恒温振荡24 h。结束后静置取上清液2 mL，进行白菊米多糖脱色率和多糖保留率测定。

1.2.5 树脂脱色工艺单因素考察

1.2.5.1 树脂用量对脱色率、多糖保留率的影响

固定脱色温度50℃，脱色时间2 h，分别取3、6、9、12、15、18 g大孔树脂于具塞锥形瓶中，加入5 mg/mL白菊米多糖溶液30 mL，振荡脱色，计算多糖脱色率和保留率，绘制树脂用量对多糖脱色率和保留率曲线。

1.2.5.2 时间对脱色率、多糖保留率的影响

固定树脂用量12 g，脱色温度50℃，分别设置脱色时间0.5、1、2、3、4、5 h。在具塞锥形瓶中加入5 mg/mL白菊米多糖溶液30 mL，振荡脱色，计算多糖脱色率和保留率，绘制脱色时间对多糖脱色率和保留率曲线。

1.2.5.3 温度对脱色率、多糖保留率的影响

固定树脂用量12 g，脱色时间2 h，分别设置脱色温度20、30、40、50、60、70℃。在具塞锥形瓶中加入5 mg/mL白菊米多糖溶液30 mL，振荡脱色，计算脱色率和多糖保留率，绘制脱色温度对多糖脱色率和保留率曲线。

1.2.6 白菊米多糖脱色正交试验

在单因素实验基础上，对树脂用量、脱色时间、脱色温度进行3因素3水平的L9(3)3正交实验设计[8]，实验因素水平如表1所示。

表1 正交实验因素水平表

1.2.7 验证性实验

以正交实验结果中的最佳脱色工艺，平行实验测定3次，计算脱色率和多糖保留率。

2 结果与讨论

2.1 脱色树脂筛选

五种不同型号树脂脱色结果见表2。D101大孔树脂脱色中，白菊米多糖保留率达64.48%，脱色率达51.41%，与其他树脂相比，脱色率较高且对多糖保留率的影响较小。因此选择其进行进一步脱色工艺优化。

表2 五种不同型号树脂脱色率、多糖保留率结果

2.2 单因素实验结果

2.2.1 树脂用量对脱色率、多糖保留率的影响

图1所示，随着树脂用量的增加，多糖脱色率逐渐增加，但多糖保留率在降至60%左右时基本保持不变。当树脂用量为12 g/100 mL多糖溶液时，多糖脱色率为40.69%，多糖保留率为62.21%。继续增加树脂用量，多糖脱色率增加不大，综合考虑选择12 g/100 mL树脂用量作为本实验最佳树脂量。

图1 树脂用量对多糖脱色率和保留率的影响

2.2.2 时间对脱色率、多糖保留率的影响

由图2可知，随脱色时间增加，多糖保留率先增后减，脱色率呈上升趋势。当脱色时间为2 h时，多糖保留率为68.66%，此时脱色率为45.66%。在2 h之前，脱色时间过短导致脱色率不高，而2 h之后，脱色率增加并不明显但多糖保留率呈明显下降趋势，故选择2 h为最佳脱色时间。

图2 脱色时间对多糖脱色率和保留率的影响

2.2.3 温度对脱色率、多糖保留率的影响

从图3可知，多糖脱色率随时间的延长呈下降趋势，多糖保留率受温度影响变化不大。当脱色温度为30℃时，脱色率为44.98%，多糖保留率为60.25%，温度继续升高，脱色率明显下降，可能高温影响树脂结构使脱色率下降。综合考虑，选择30℃为最佳脱色温度。

图3 脱色温度对多糖脱色率和保留率的影响

2.3 正交实验结果分析

以脱色率和多糖保留率为考察指标，对白菊米多糖脱色树脂用量、脱色时间和脱色温度进行3因素3水平的 L9(3)3正交实验设计(表1)。从表3实验结果可知，3个因素对实验结果的影响顺序分别为 A > B > C，即脱色树脂用量>脱色时间>脱色温度，在实验考察范围内，最优组合为A1B2C2，即树脂用量9 g/100mL多糖溶液，脱色时间2 h，脱色温度30℃时脱色效果和多糖保留率综合为最佳。从表4方差分析可知，树脂用量对实验结果有显著性影响(P < 0.05)。在此最优工艺条件下，对白菊米多糖大孔树脂脱色进行3次重复验证性实验，得到多糖脱色率为45.72%，多糖保留率为64.28%。

表3 大孔树脂脱色正交实验结果分析

表4 大孔树脂脱色正交实验方差分析

3 结论

本文通过单因素和正交实验设计，对白菊米多糖大孔树脂脱色工艺进行优化。得到最佳脱色工艺为：D101大孔树脂用量9 g/100mL多糖溶液，脱色时间2 h，脱色温度30℃。在此工艺条件下对白菊米多糖进行脱色，计算得到脱色率为45.72%，多糖保留率为64.28%，脱色后白菊米颜色明显变浅。白菊米多糖的结构及生物活性还需进一步研究，该实验为白菊米多糖的综合开发利用提供依据。