电针对慢性不可预见性温和应激抑郁模型大鼠血清炎症因子及单胺类物质的影响*

赵 俊，田会玲，宋洪涛，王 旭，罗 彤，艾丽雅，房毓敏，赵江豪，赛音朝克图，李志刚△

(1.北京中医药大学,北京 100029; 2.内蒙古呼和浩特市内蒙古人民医院,内蒙古 呼和浩特 010010; 3.内蒙古自治区国际蒙医医院,内蒙古 呼和浩特 010065； 4.北京中医药大学东方学院,廓坊 065001)

抑郁症(depression)被归类为精神疾病。 临床主要表现为持续性抑郁、孤独、焦虑、认知功能障碍和高自杀率，这给患者和家庭带来严重的精神压力和经济负担[1-2]。 与此同时，调查数据显示全球约有3.5亿人患有抑郁症，而且人数正在逐年增加[3-4]。 世界卫生组织(WHO)预测到2030年抑郁症将成为全球慢性疾病的第一杀手，威胁人类的心理健康[5]。 选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRIs)如盐酸氟西汀通常是用于治疗抑郁症的首选药物，但临床上约有50%的患者对治疗无效[6]。 因此，替代治疗方案可能提供新的抗抑郁药策略[7]。

针灸治疗抑郁症疗效确切并可以缓解抗抑郁药物的副作用[8]，临床治疗应用日益受到关注。近年来，针刺治疗抑郁症的机制探讨逐步深入，根据抑郁症发病的“细胞因子假说”[9]，认为慢性应激因素刺激后可以引起免疫激活，释放各种炎性细胞因子，如白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等，导致抑郁症的发生发展[10]。此外，20世纪科学家还提出了抑郁症的“单胺类假说”，认为抑郁症的发生与中枢神经系统内单胺类递质如去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)和5-羟色胺(5-HT)水平或功能下降有关[11]。已有临床研究发现，针刺百会、足三里等穴能显著降低抑郁症患者血清IL-6和TNF-α的水平[12-13]；针刺肝俞、肾俞等穴能显著升高女性更年期抑郁症患者血清NE、DA及HIAA的含量[14]。另有报道[15]指出百会穴(GV20)对神经内分泌和免疫系统有良性调节作用；印堂穴(GV29)同样对神经系统也有调节作用，导致5-HT等神经递质释放，参与抑郁症的发生。百会与印堂被认为是治疗抑郁症的首要穴位[16]，课题组前期研究发现电针百会、印堂穴对抑郁症治疗有效[17]，并且电针能调节中枢炎症因子及神经递质水平[18-19]，但电针对血清中炎性细胞因子和单胺类物质的影响尚不明确。本实验拟采用慢性不可预见性温和应激(CUMS)抑郁大鼠模型，观察电针刺激百会、印堂穴后对血清IL-6 、TNF - α 、NE 、DA及HIAA含量的影响，探讨电针治疗抑郁症的可能机制及潜在靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 成年健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠24只，8～9周龄，体质量为160～220 g。由北京维通利华实验动物公司提供，许可证号：SCXK(京)2016-0006。将所有大鼠置于温度(22±2)℃和相对湿度(35±2)%的环境中，饲养室通风良好且自然光充足，条件相对稳定，饲养7天以适应环境。实验程序经北京中医药大学动物实验伦理委员会批准。

1.1.2 主要实验试剂及药物 IL-6和TNF-α ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所)；单胺类神经递质标准品：去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)(美国Sigma公司);色谱级甲醇(fisher)、L-半胱氨酸(amresco)、磷酸二氢钠(merck)、辛烷磺酸钠(Alfa)、乙二胺四乙酸二钠(Alfa)、氯化钾(Alfa)都是进口分析纯(美国Sigma公司);氟西汀(礼来苏州制药有限公司，批号:J20170022)。一次性针灸针(北京中研太和医疗器械有限公司)；韩氏电针仪(北京华卫产业有限公司，LH202)；超声破碎仪(美国SONICS)；台式冷冻离心机(德国HERAEUS)。

1.2 分组、造模及干预方法

为确保实验造模刺激之前基线特征的一致性，在应激前1天测量了体质量，并进行高架十字迷宫实验(Elevated plus maze,EPM)。踢除4只基线特征不一致的大鼠，将具有相似体重和EPM基线特征的24只大鼠随机分为4组，即正常组、模型组、氟西汀组与电针组(每组6只)。除应激刺激期外，所有大鼠可自由进食和饮水。 干预均于每日上午10点进行，模型组、氟西汀组和电针组每日随机接受1种应激刺激方式，造模期为第8～36天，共28天。见图1。

图1 CUMS刺激方式造模实验时间表

本研究结合慢性不可预见性温和应激建立CUMS模型[20]。应激刺激方法包括4℃冷水游泳5 min；禁或禁食24 h；昼夜颠倒24 h；束缚3 h；夹尾3 min；笼位倾斜24 h；潮湿环境24 h。为了确保刺激方式不可预测，每天的刺激顺序随机抽签产生，且同一刺激不连续应用，共持续28天。

除正常组大鼠群养以外，其余各组单笼饲养。正常组自由饮水食，不接受任何刺激。模型组每日接受随机慢性应激造模刺激处理后，不接受任何治疗。 氟西汀组每日应激刺激后1 h，用生理盐水配制1 mg/mL的氟西汀稀释药液，按照2 mg/kg灌胃给药。电针组应激1 h后，固定于自制鼠套中，参照张露芬主编《实验针灸学》选取相当于人体解剖部位的 “印堂”和“百会”穴[21]。局部消毒后，选用0.25 mm×25 mm一次性针灸针，针刺深度约为5～10 mm，且针体与皮肤保持15°夹角，“印堂”穴针尖向下倾斜，“百会”穴针尖向上倾斜，小幅度轻捻转后，针柄接韩氏电针仪，频率2 Hz，电流强度1 mA，连续波，刺激强度维持在头部肌肉轻微振动且不嘶叫为宜，持续20 min，每天1次，治疗28天。

1.3 检测方法

1.3.1 高架十字迷宫实验(EPM) 评价动物抑郁样行为的首要装置，利用动物对新高悬敞开臂环境的好奇心和恐惧心理(开臂)以及嗜暗天性(闭臂)，形成动物的探究与回避的矛盾冲突来考察动物的抑郁焦虑状况[22]。实验将每只大鼠于十字迷宫中央平台处放入，使其头部正对其中1个封闭臂，释放后计时5 min并记录以下指标:进入开放臂次数(Open arm entry,OE)、 进入封闭臂次数(Close arm entry,CE)、进入开放臂时间(Open arm time,OT)和进入封闭臂时间(Close arm time,CT)。根据上述指标计算：开放臂的次数比例OE(%)=OE/(OE+CE)×100%；和开放臂停留时间比例OT(%)=OT/(OT+CT)×100%。

1.3.2 ELISA法检测血清IL-6 和TNF-α含量 实验第36天，大鼠称重后予10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)腹腔麻醉后迅速腹主动脉取血5 mL，静置后离心(4℃，3 000 rpm，15 min)，取上清液于-80℃保存备用。每只大鼠取样50 μL，严格按照ELISA试剂盒说明书操作测定血清IL-6和TNF-α的水平。

1.3.3 HPLC法检测血清中NE、DA和5-HIAA含量 HPLC设备包括Agilent 1 100 LC高效液相色谱仪和DECADE II SDC电化学检测器。 Skyam®的Atlantis C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，3 μm)。使用由0.1 mol/L KH2PO4和甲醇(10∶1，V/V；pH=3)组成的流动相进行色谱分离，流速为0.2 mL/min，柱温30℃，检测电极电位为500 mV。

配制裂解液：称取(0.05 g 0.01%L-半胱氨酸，0.1 g 0.5 mmol/L EDTA二钠，9 mL 0.2 mol/L高氯酸)并用超纯水稀释成100 mL的血清裂解液。每只大鼠取样250 μL，将裂解液以1∶5的比例加入血清中(即50 μL血清中加入10 μL裂解液)。冰浴条件下超声破碎10 s。4℃，15 000 r/min离心30 min，取上清液-80℃冻存以析出蛋白，检测前再15 000 r/min离心30 min，取上清液用0.22 μm耐酸过滤器过滤后，将10 μL注入HPLC系统进行分析。待检血清单胺类神经递质NE、DA和5-HIAA，各神经递质浓度含量以ng/L表示。

1.4 统计学方法

2 实验结果

2.1 高架十字迷宫实验(EPM)结果

实验应激前，各组大鼠在开放臂的次数比例(OE%)和开放臂停留时间比例(OT%)均无显著性差异(P>0.05)。实验应激后，与正常组比较，模型组OE%和OT%明显下降(P<0.01)，表明造模成功；与模型组比较，氟西汀组大鼠OE%和OT%值上升(P<0.01或P<0.05)，电针组OE%和OT%值亦存在显著差异(P<0.01),提示经过氟西汀和电针干预后可以改善这种焦虑抑郁样行为。见表1。

表1 高架十字迷宫实验开放臂次数和停留时间比较

注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；与氟西汀组比较，△P<0.05，△△P<0.01。

2.2 ELISA检测结果

与正常组比较，模型组大鼠血清IL-6和TNF-α含量均升高(P<0.05)，差异有统计学意义。经氟西汀和电针治疗后，与模型组比较，氟西汀组IL-6和TNF-α含量均降低(P<0.01),电针组IL-6和TNF-α含量同样显著降低(P<0.01)；与氟西汀组比较，电针组IL-6和TNF-α含量减少，但无统计学差异(P>0.05)。见表2。

表2 ELISA检测结果

注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；与氟西汀组比较，△P<0.05，△△P<0.01。

2.3 HPLC检测结果

与正常组比较，模型组大鼠血清NE含量显著降低(P<0.05)。经氟西汀和电针治疗后，与模型组比较，电针组DA含量变化最为显著(P<0.01)，NE、5-HIAA含量升高，接近正常水平，但无统计学差异；与模型组比较，氟西汀组5-HIAA含量升高(P<0.01)；与氟西汀组相比，电针组DA、5-HIAA含量差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3、图2。

表3 HPLC检测结果

注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；与氟西汀组比较，△P<0.05，△△P<0.01。

图2 NE、DA、5-HIAA检测结果

3 讨论

抑郁症通常被认为是具有复杂病理生理学和不同信号传导途径的多系统疾病。中医认为百会和印堂为督脉的要穴，百会主一身之宗，百神之会，且与足太阳膀胱经穴相交会，通过调节太阳经(心俞、肝俞、脾俞、肾俞；神堂、魂门、意舍)等背俞穴而与五脏六腑关系密切，故能协调阴阳、调和五脏精神、通调髓海，有百脉朝宗之效。而印堂穴能安神醒脑、益智定惊，正所谓“经脉所过，主治所及”，与百会穴能一同发挥“近治功效”，因此本研究选取督脉上的印堂、百会穴治疗神志疾病，符合中医治病必求于本之说[23]。

临床研究[24]表明慢性应激可以引发患者抑郁样行为，电针治疗对抑郁症有一定的改善作用[16]。抑郁症的“细胞因子假说”，认为长时间的慢性应激会导致机体免疫系统损伤，免疫系统会在应激下持续激活，单核-巨噬细胞活动增加，致炎性细胞因子(IL-6、TNF-α等)释放增加[25]。动物实验表明，致炎因子IL-6、TNF-α等在抑郁模型体内的水平显著升高，该研究结论得到普遍认同[26]。临床研究[27]发现抑郁症患者存在免疫系统功能的改变，中枢炎性因子如IL-1β、IL-6、TNF-α等表达上调。另有报道[28]指出抑郁症患者血清致炎性因子(IL-6、TNF-α)水平明显增高，且随着病情的加重炎性因子水平也随之升高。以上研究提示中枢和外周IL-6、TNF-α水平的变化可能反映抑郁症的严重程度。

另有报道[29]指出慢性应激会导致免疫系统中调节细胞功能的小分子多肽——细胞因子分泌异常，炎性细胞因子通过对神经递质等方面的影响，可引起神经递质的水平过低，神经发生减少，进而导致抑郁症发生[30]。既往研究发现，核因子-κB可介导外周炎性细胞因子进入中枢，结合相应的受体，通过影响神经递质的合成及释放进而影响抑郁症的发生发展[31]。

本研究结果表明慢性应激造模后，大鼠开放臂的次数比例(OE%)和停留时间比例(OT%)明显下降，模型大鼠表现抑郁焦虑样行为，这与临床抑郁症患者症状极为相似[32]，提示本实验成功建立抑郁模型。本次研究结果表明慢性应激可以引起抑郁大鼠血清IL-6和TNF-α含量显著升高，既往研究发现[33]，IL-6、TNF-α含量升高与抑郁症发生呈正相关，本次研究与该研究结论相似。电针治疗可以显著降低模型大鼠血清中上述炎性细胞因子水平，这与针刺可以显著降低慢性应激抑郁大鼠血清IL-6和TNF-α含量[34]结果一致。血清中的单胺物质检测结果显示，应激后模型组大鼠血清NE、DA和5-HIAA含量降低，经氟西汀和电针治疗后，NE、5-HIAA含量有不同程度的升高，氟西汀治疗后5-HIAA较电针治疗变化明显，而电针治疗后5-HIAA接近正常水平，这可能是抗抑郁药物副作用的缘故。抗抑郁药物主要是依据单胺能递质缺乏假说研发而成，是通过调节体内单胺类神经递质水平来实现的抗抑郁效应[35]，特别是多巴胺受体，在抑郁症的发展中发挥着重要的作用，经氟西汀治疗后，大鼠DA含量升高，与药物的功效趋势相符合。较氟西汀治疗效果而言，电针治疗后DA含量变化最为显著，这与针刺可以显著增加DA表达结果一致[36]，表明电针治疗在改善DA含量方面较单纯氟西汀治疗更为有效。

本实验结果表明，电针治疗可以恢复慢性轻度不可预测的轻度应激诱导的大鼠抑郁样行为，降低应激抑郁大鼠血清IL-6和 TNF-α的表达，缓解外周免疫炎症反应，同时还能促进机体单胺类神经物质，特别是DA的分泌，这可能是电针发挥抗抑郁效应的机制之一。