多指标综合加权评分法优选清感退热汤加减方的提取工艺△

张春艳，李玥，杨莎莎，成睿珍

1.天津市滨海新区中医医院，天津 300450；2.天津中医药大学，天津 300193

清感退热汤加减方是天津市滨海新区中医医院儿科广泛使用的临床经验方，由“清感退热汤”作为基础方进行加减而成。清感退热汤经过多年临床实践，结合理论辨证施治，已取得了良好的疗效，以本方为基础的加减方已治疗了数百例患者[1]。

研究表明，不同的提取工艺会对汤剂的疗效产生不同程度的影响[2-3]。然而，作为儿科常用药，清感退热汤加减方目前尚未有较为完善的提取工艺。为了明确清感退热汤的提取工艺，确保其质量和临床疗效，本文对加减方中君药葛根，臣药黄芩的有效成分进行测定，以葛根素、黄芩苷和汉黄芩苷的含量为指标，采用正交试验结合综合加权评分法优化清感退热汤的提取工艺，为研发稳定、可行、质量可控的清感退热汤提取工艺提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Alltech 1500系列Q 05型高效液相色谱仪；Agilent Eclipse C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；UV-6100 PCS型紫外可见分光光度计(上海美普达有限公司)；FA 2104型精密电子分析天平(上海舜宇恒平科技仪器有限公司)；JE 1001型电子天平(上海浦春计量仪器有限公司)；KDM调温电热套(山东省鄄城精佳仪器有限公司)；SB 25-12 DT超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 试药

黄芩苷对照品(批号：MUST-11101403)、汉黄芩苷对照品(批号：MUST-16111611)、葛根素对照品(批号：MUST-11043001)均购于成都曼斯特生物科技有限公司，纯度≥98%；甲醇、乙腈色谱纯(天津市康科德科技有限公司)；磷酸为优级纯(天津市江天化工技术有限公司，纯度≥98%)；实验用水为娃哈哈纯净水。

中药饮片由天津市滨海新区中医医院药学科提供，经刘海副主任中药师鉴定，均符合2015年版《中华人民共和国药典》的规定。

2 方法与结果

2.1方法学的建立

2.1.1 色谱条件 色谱柱Agilent Eclipse C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇(A)-0.1%磷酸水溶液(B)梯度洗脱(见表1)；流速1.0 mL·min-1；检测波长270 nm；柱温为常温；进样量10 μL。

表1 梯度洗脱程序

2.1.2 对照品溶液的制备 分别精密称取对照品葛根素0.9 mg、黄芩苷2.9 mg、汉黄芩苷1.0 mg，分别置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，即得。

2.1.3 供试品溶液的制备 称取处方饮片：葛根10 g，黄芩10 g，生石膏30 g等，共108 g。回流提取并用300目滤布对提取液进行过滤。取1 mL滤液置10 mL容量瓶中，用甲醇定容，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 阴性供试品溶液的制备 按处方比例称取除黄芩或除葛根以外的其余药材，按2.1.3项下方法制备，分别制得无黄芩的阴性供试品溶液和无葛根的阴性供试品溶液。

2.1.5 专属性试验 精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，测定。结果表明此方法专属性良好。色谱图见图1。

注：A.混合对照品；B.供试品；C.无葛根的阴性供试品；D.无黄芩的阴性供试品；1.葛根素；2.黄芩苷；3.汉黄芩苷。图1 对照品及供试品溶液HPLC图

2.1.6 标准曲线的绘制 精密量取上述混合对照品储备液，用甲醇逐级稀释，制成一系列不同浓度的对照品溶液，按照2.1.1项下色谱条件进样，以色谱峰面积(Y)为纵坐标，进样量(X)为横坐标，绘制标准曲线并进行回归计算。葛根素、黄芩苷和汉黄芩苷的回归方程分别为Y=3×109X-96 526(r=0.999 9)，Y=2×109X-215 803(r=0.999 9)，Y=5×109X-75 545(r=0.999 7)；线性范围分别为：0.09～0.72、0.29～5.8、0.04～0.24 μg。结果表明，葛根素、黄芩苷和汉黄芩苷在其相应的线性范围内线性关系良好。

2.1.7 精密度试验 精密吸取高、中、低3种不同浓度的葛根素、黄芩苷和汉黄芩苷对照品溶液，按2.1.1项下的色谱条件连续进样5次，测定3种成分的峰面积，计算各成分的含量，求得日内精密度，其RSD值分别为0.46%、0.13%、0.52%。

取同一对照品溶液连续进样3 d，测定峰面积，计算各成分的含量，求得日间精密度，其RSD值分别为0.12%、0.09%、0.36%。结果表明，实验仪器的日间日内精密度良好。

2.1.8 稳定性试验 取处方按2.1.3项下方法制备供试品溶液，按2.1.1项下色谱条件分别于0、2、4、6、8、12、24 h进样，测定葛根素、黄芩苷和汉黄芩苷3种成分的峰面积，计算各成分的含量，其RSD值分别为0.77%、0.21%、0.47%。结果表明，供试品溶液在室温下24 h内稳定。

2.1.9 重复性试验 取处方按2.1.3项下方法制备供试溶液6份，按2.1.1项下色谱条件分析，测定葛根素、黄芩苷和汉黄芩苷3种成分的峰面积，计算各成分的含量，其RSD值分别为0.68%、0.42%、0.54%，结果表明，此法重复性良好。

2.1.10 回收率试验 精密量取已知含量的供试液6份，分别加入等量的对照品，按2.1.3项下方法制备供试品溶液，按2.1.1项下色谱条件测定，记录峰面积，计算加样回收率。求得葛根素、黄芩苷和汉黄芩苷的加样回收率分别为100.10%、99.63%、101.01%，其RSD值分别为0.68%、1.44%、1.09%。结果表明，此方法加样回收率良好。

2.2 最佳提取工艺的优选

2.2.1 单因素考察 按处方量称取药材，分别加入6、8、10倍量水，均回流提取1次，每次1 h，平行3份。按2.1.1项下色谱条件分析，测定3种成分的峰面积并计算各成分的含量，求得葛根素、黄芩苷和汉黄芩苷的提取量分别为：10倍量水22.5、81.64、8.91 mg·g-1(RSD值分别为1.27%、1.75%、1.81%)；8倍量水25.53、78.99、8.17 mg·g-1(RSD值分别为0.85%、0.09%、0.05%)；6倍量水19.87、66.38、7.24 mg·g-1(RSD值分别为0.41%、0.39%、0.32%)。

2.2.2 多指标成分权重分析 按照处方中君臣佐使及含量进行分析，将葛根素、黄芩苷和汉黄芩苷的权重系数分别定为0.6、0.2、0.2。

综合评分=(葛根素含量/葛根素最大含量)×100×0.6+(黄芩苷含量/黄芩苷最大含量)×100×0.2+(汉黄芩苷含量/汉黄芩苷最大含量)×100×0.2

(1)

2.2.3 正交设计 采用正交设计IIV3.1优选最佳工艺，选择3因素3水平(见表2)，按L9(34)正交设计进行试验。以处方中主要药材的主要有效成分作为测定指标，采用加权综合评分法，对实验结果进行数据统计，以指标成分的含量和综合评分值对实验结果进行直观分析(见表3)和方差分析(见表4)，确定最佳提取工艺。

表2 因素水平表

表3 正交试验结果

表4 综合评分方差分析

由表2的R值直观分析和表3方差分析可知，各考察因素对考察指标影响大小的次序为C>A>B，其中加水量(A)差异有统计学意义(P<0.10)，提取次数(C)差异有统计学意义(P<0.05)，而提取时间(B)在实验所设范围内无差异。综合正交设计结果、时间和成本问题，得出最佳试验方案为A2B1C3，即8倍量水，提取0.5 h，提取3次。

2.2.4 验证实验 按处方量比例称取同一批药材，平行3份，按优化的最佳提取工艺进行提取，测得葛根素、黄芩苷和汉黄芩苷的质量分数分别为37.35、135.58、15.53 mg·g-1，RSD分别为1.06%、0.13%、0.19%。结果表明，该工艺稳定可行。

3 讨论

3.1 流动相的选取

有关葛根素、黄芩苷和汉黄芩苷的含量测定，经查阅文献[4-7]发现，研究者多用乙腈、甲醇作为有机相，实验中选取了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水、甲醇-0.1%磷酸水作为流动相。实验发现当选用甲醇-0.1%磷酸水作为流动相时，在相同的分离时间内各峰的峰形和分离度均较好。

3.2 波长的选取

分别取葛根素、黄芩苷和汉黄芩苷对照品溶液，用紫外可见分光光度计检测出各指标成分的最大吸收波长分别为239、279、270 nm。因葛根素和其他成分的最大吸收峰差距较大，故分别选取240、245、250、255、260、265、270、275 nm作为检测波长，对供试品溶液进行分析。实验发现，270 nm下葛根素、黄芩苷和汉黄芩苷的峰面积响应值相对较大，故以270 nm作为检测波长。

3.3 权重系数的选取

本实验通过对主要药味的有效成分进行含量测定，根据复方中不同药味的地位分配权重，进行多指标成分权重分析。葛根甘、辛、凉，有解肌退热，生津止渴等功效，可协助柴胡透汗解热，主要用于外感发热恶寒无汗、项背强痛等，为方中君药，故将葛根素权重系数定为0.6。黄芩苦寒，具有清热燥湿、泻火解毒等功效[8]，能清泻上焦肺火、除肠中湿热，为方中臣药，有效成分为黄芩苷和汉黄芩苷，故其权重系数分别定为0.2和0.2。

3.4 提取工艺的确定

通过表3中的R值，直观分析得出的最佳工艺是A2B3C3，即8倍量水，提取1.5 h，提取3次。由表3方差分析表可知，提取时间在实验所设范围内对实验结果无影响，从时间和成本方面考虑，最终选择最短提取时间0.5 h，从而得出最佳工艺为A2B1C3。

本文首次测定了清感退热汤中葛根素、黄芩苷和汉黄芩苷3种有效成分的含量，并优化了提取工艺。研究表明，本法简便、灵敏、重复性好，可用于清感退热汤加减方的质量控制，以确保临床疗效；提取工艺稳定可行，为进一步开发利用该处方提供了参考。