2种中国樱桃果实有机酸积累及代谢相关酶活性的研究

李 航，陶海青，陈益香，龚成宇，杨 科，龚荣高

(四川农业大学 园艺学院，成都 611130)

中国樱桃(CerasuspseudocerasusLindl.)隶属蔷薇科李亚科樱属，起源于中国，有着3000余年的栽培历史[1]，是世界四大樱桃栽培种之一[2]，果实营养丰富，富含磷、铁、维生素C和胡萝卜素等[3-4]，一直深受消费者的喜爱。己有的研究表明，果实中的有机酸种类、质量分数及其构成比例和形成动态是果实风味形成的重要基础[5]，果实中有机酸组分很多，但大多数果实通常以1种或2种有机酸为主，其他仅以少量或微量存在。有机酸质量分数与果实的酸度有显著的相关性，不仅对平衡果实的风味非常重要[6]，而且在果实的光合作用，呼吸作用，以及成酚类、酯类和氨基酸的合成中发挥重要作用[7]。果实中有机酸的合成代谢途径受代谢相关酶活性的调控(代谢途径见图1)[8-11]，其中调控苹果酸代谢的酶主要包括苹果酸脱氢酶(NAD-MDH)、苹果酸酶(NADP-ME)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)。PEPC主要催化PEP生成OAA以及无机磷[12]，NAD-MDH能够将OAA氧化成苹果酸，从而快速降低OAA的质量分数[13]；NADP-ME主要催化苹果酸生成丙酮酸，对苹果酸的降解起到催化作用，在成熟苹果果实里的NADP-ME活性的增加能够减少有机酸的质量分数[14]；而柠檬酸合成酶(CS)主要催化OAA和Ac-CoA缩合产生柠檬酸。中国樱桃果实具有很高的食用价值，但目前果实有机酸质量分数偏高是中国樱桃产业的问题之一，研究中国樱桃果实有机酸代谢对于中国樱桃产业的发展有重大的理论和实践意义，而且对于中国樱桃果实中有机酸代谢机制的研究也相对较少。因此，本试验以‘黑樱桃’和‘红樱桃’2种中国樱桃为材料，测定中国樱桃果实发育过程中有机酸组分及质量分数、相关酶活性，探讨中国樱桃果实发育过程中有机酸积累的机理，为进一步研究果实有机酸代谢提供理论依据，同时为中国樱桃生产栽培、品种选育、提高中国樱桃果实品质提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与处理

取样地位于四川省雅安市汉源县，属亚热带季风性气候，冬暖夏凉，四季分明。年平均气温17.9 ℃，无霜期300 d，年平均日照时间1 475.8 h，年活动积温5 844.7 ℃，年均降雨量741.8 mm。

以汉源县当地栽培的‘黑樱桃’和‘红樱桃’为试材，每种试材选择树势中庸、生长健壮、长势相近的10 a生植株5株作为供试植株，采用常规管理。盛花期开始，从每株供试植株中选择大小基本一致，具有代表性的花序挂牌标记。

图1 果实细胞有机酸代谢途径Fig.1 Organic acid metabolism in fruit cell

1.2 取样方法

在盛花后6、12、18、24、30、36、42 d取样。在10株供试植株树冠外围1～2 m处取样，每株选择无病虫害、中等大小的果实40个，用冰盒带回实验室，用液氮速冻分装后于-80 ℃超低温冰箱中保存。

1.3 果实生长发育动态测定

果实单果质量用万分之一天平测定，纵横径用数显游标卡尺测定。

1.4 有机酸质量分数测定

苹果酸、酒石酸、奎宁酸和柠檬酸的质量分数采用高效液相色谱法(HPLC)测定，提取和测定方法参考马倩倩等[15]和张丽丽等[16]的方法并略加改进。使用Agilent高效液相色谱仪(Agilent 1260Ⅱ)测定，色谱柱为C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为0.04 mol·L-1KH2PO4，柱温为30 ℃，紫外检测器，检测波长210 nm，流速 0.5 mL·min-1，进样量10 μL。

1.5 蔗糖代谢相关酶活性测定

酶液的制备，苹果酸脱氢酶(NAD-MDH)、苹果酸酶(NADP-ME)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)和柠檬酸合成酶(CS)活性的测定参考龚荣高等[17]和李甲明等[18]的方法，并略加改进。

1.6 数据处理

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 19.0软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 2种中国樱桃单果质量变化

由图2可见，2种中国樱桃果实发育持续时间在42 d左右，2种樱桃果实发育呈慢—快的生长趋势，在花后6～24 d(幼果期)单果质量增长速率较慢；花后30 d后果实进入转色膨大期，果实单果质量迅速增加，推测此时期为2种中国樱桃果实发育的关键时期；整个发育过程中‘红樱桃’单果质量明显高于‘黑樱桃’，成熟时‘黑樱桃’单果质量为2.72±0.11 g，‘红樱桃’单果质量为 3.74±0.17 g。

2.2 2种中国樱桃纵横径变化

由图3可见，在果实发育前期(花后6～ 24 d)，中国樱桃果实纵径大于横径，纵径横径缓慢上升；从花后30 d开始果实横径迅速上升，并明显高于横径，横径变化较为平稳。成熟时‘黑樱桃’纵径1.70±0.085 cm，横径1.87±0.086 cm，果形指数为0.92；‘红樱桃’纵径1.66±0.084 cm，横径2.02±0.089 cm，果形指数为0.82。果实成熟时，‘黑樱桃’果实指数高于‘红樱桃’，使得‘红樱桃’比‘黑樱桃’果形更偏扁圆形，也与成熟时‘红樱桃’果实单果质量大于‘黑樱桃’相一致。

2.3 2种中国樱桃果实有机酸质量分数变化

由图4可见，在整个发育时期，2种中国樱桃成熟果实中有机酸以苹果酸为主，苹果酸和酒石酸质量分数变化趋势和总酸质量分数变化相近，总体呈先上升后降低的变化趋势，花后13 d开始，果实苹果酸和总酸质量分数开始迅速上升，在花后30 d质量分数上升到最高，花后30 d开始逐渐降低。发育期内，‘黑樱桃’奎宁酸质量分数变化不大，‘红樱桃’奎宁酸质量分数从花后30 d开始呈降低的趋势；2种中国樱桃果实柠檬酸质量分数呈升高—降低—升高—降低的变化趋势，在花后24 d柠檬酸质量分数最低，花后30 d质量分数最高，花后30 d开始降低。

图2 樱桃果实发育过程单果质量变化Fig.2 Changes of fruit mass during cherry fruit development

a.黑樱桃 Heiyingtao；b.红樱桃 Hongyingtao

花后42 d果实成熟时‘黑樱桃’苹果酸质量分数为4.62±0.15 mg·g-1，占总酸质量分数的89%；‘红樱桃’苹果酸质量分数为5.50±0.11 mg·g-1，占总酸质量分数的85%。奎宁酸和柠檬酸质量分数相近，‘黑樱桃’奎宁酸和柠檬酸占总酸质量分数的5%和4%，‘红樱桃’奎宁酸和柠檬酸占总酸质量分数的9%和4%；酒石酸质量分数最低，占总酸质量分数的1%。‘红樱桃’成熟果实中各有机酸质量分数均高于‘黑樱桃’。

2.4 2种中国樱桃果实中有机酸代谢相关酶活性变化

2.4.1 苹果酸脱氢酶活性 由图5可以看出， 2种中国樱桃果实苹果酸脱氢酶(NAD-MDH)活性总体呈先升高再降低趋势，与苹果酸变化趋势相近，在花后12～30 d NAD-MDH 活性呈上升趋势，在花后30 d活性达到最高，‘黑樱桃’为 12.39±0.62 U·g-1·min-1，高于‘红樱桃’的 11.39±0.41 U·g-1·min-1。花后30 d后NAD-MDH活性迅速下降，成熟时‘黑樱桃’果实中NAD-MDH的活性最低，为3.85±0.21 U·g-1·min-1，‘红樱桃’为4.77±0.55 U·g-1·min-1，‘红樱桃’果实中NAD-MDH活性高于‘黑樱桃’。两者相比较而言，花后12 d前‘红樱桃’NAD-MDH活性有小幅度降低；‘黑樱桃’NAD-MDH活性在花后12～30 d期间高于‘红樱桃’，花后30 d后，‘黑樱桃’该酶降低幅度大于‘红樱桃’，‘红樱桃’该酶活性更高。

图4 樱桃果实发育过程酸组份质量分数变化Fig.4 Changes in acid mass fraction during the development of cherry fruit

图5 樱桃果实发育过程苹果酸脱氢酶活性变化Fig.5 Changes in NAD-MDH activity during the development of cherry fruit

2.4.2 苹果酸酶活性 由图6可以看出，2种樱桃果实发育过程中苹果酸酶(NADP-ME)活性总体呈先下降再上升的趋势；花后30 d前NADP-ME活性持续下降且变化较为平稳，在花后30 d下降到最低值，‘黑樱桃’最低为0.04±0.02 U·g-1·min-1，‘红樱桃’最低为0.09±0.05 U·g-1·min-1；花后30 d后，2种樱桃NADP-ME活性迅速上升，成熟时该酶活性到达最高，‘黑樱桃’最高为1.12±0.07 U·g-1·min-1，‘红樱桃’最高为0.78±0.05 U·g-1·min-1。两者相比较，花后24 d前NADP-ME活性变化趋势相反，花后24 d后变化趋势相同，从花后30 d开始，‘黑樱桃’NADP-ME活性一直高于‘红樱桃’。

图6 樱桃果实发育过程苹果酸酶活性变化Fig.6 Changes in NADP-ME activity during the development of cherry fruit

2.4.3 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性 由图7可以看出，2种樱桃果实磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)活性总体呈先升高再降低趋势，在花后24 d前PEPC活性上升且变化平稳，花后24～ 30 d迅速上升并到达峰值，‘黑樱桃’最高为0.96±0.03 U·g-1·min-1，‘红樱桃’为0.99±0.05 U·g-1·min-1。果实发育后期(花后30～ 42 d)，2种樱桃果实PEPC活性迅速下降，果实成熟时降至最低，‘黑樱桃’最低为0.32±0.05 U·g-1·min-1，‘红樱桃’为0.31±0.04 U·g-1·min-1。2种樱桃相比较，‘黑樱桃’果实PEPC活性在整个发育期内都高于‘红樱桃’。

图7 樱桃果实发育过程磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性变化Fig.7 Changes in PEPC activity during the development of cherry fruit

2.4.4 柠檬酸合成酶活性 图8显示，‘黑樱桃’果实CS活性整体呈下降趋势，‘红樱桃’CS活性整体呈上升趋势；2种樱桃果实CS活性在发育前期(花后6～18 d)变化平稳，花后24 d CS活性迅速降低后，在花后30 d迅速上升至峰值，‘黑樱桃’最高为0.18±0.004 U·g-1·min-1，‘红樱桃’为0.21±0.01 U·g-1·min-1。果实发育后期(花后30～42 d)，2种樱桃CS活性迅速下降至果实成熟，成熟时‘黑樱桃’果实CS活性为 0.10±0.01 U·g-1·min-1，‘红樱桃’为 0.16±0.002 U·g-1·min-1。两者相比较，从花后 12 d开始，‘红樱桃’CS活性一直高于‘黑 樱桃’。

图8 樱桃果实发育过程柠檬酸合成酶活性变化Fig.8 Changes in citrate synthetase (CS) activity during the development of cherry fruit

2.5 中国樱桃果实中酸质量分数与相关酶活性相关性

由表1可以看出，在果实发育期内，‘黑樱桃’果实苹果酸和总酸质量分数也与苹果酸脱氢酶(NAD-MDH)活性呈极显著正相关(R2= 0.886**,R2=0.892**)，与苹果酸酶(NADP-ME)和柠檬酸合成酶(CS)活性呈负相关，苹果酸、酒石酸和总酸质量分数与磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)活性呈极显著正相关(R2= 0.918**,R2=0.907**,R2=0.914**)，酒石酸质量分数与苹果酸酶(NADP-ME) 活性呈极显著负相关(R2=-0.886**)；‘红樱桃’果实苹果酸和总酸质量分数与苹果酸脱氢酶(NAD-MDH)活性呈显著正相关(R2=0.801*,R2= 0.788*)，与磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)活性呈显著正相关(R2=0.855*,R2=0.855*)，与苹果酸酶(NADP-ME)活性呈负相关，柠檬酸质量分数与柠檬酸合成酶(CS)活性呈正相关。由此可知，NAD-MDH、PEPC在樱桃果实有机酸积累过程中起到关键作用。

表1 中国樱桃果实有机酸质量分数与代谢相关酶的相关性分析Table 1 Correlation analysis between organic acid mass fraction and metabolic related enzymes in Chinese cherry fruit

注：** 代表极显著性相关(P<0.01)；*代表显著性相关(P<0.05)。

Note：** means highly significant correlation(P<0.01); * means significant correlation (P<0.05).

3 讨 论

许多果实中主要有机酸在果实发育过程中呈现前期上升后期下降的变化趋势[19]，如砂梨[20]、石榴[21]和杏[22]等。本试验中，2种中国樱桃果实有机酸积累以苹果酸为主，成熟时果实中苹果酸质量分数占总酸质量分数85%以上，而其他有机酸质量分数很低，属于苹果酸型果实，与甜樱桃[23]、苹果[24]和枇杷[25]上的研究结果相似。成熟时‘黑樱桃’果实较低的有机酸质量分数决定了其风味相对于‘红樱桃’的优势。

虽然有机酸质量分数过高会导致果实风味变差，但在果实生长发育中占据重要作用，有机酸的积累受到有机酸代谢相关酶调控。本试验中，NAD-MDH和PEPC活性与苹果酸质量分数变化趋势大致相同，呈显著正相关，2种中国樱桃苹果酸积累的差异主要与2种酶活性高低有关。樱桃果实中NADP-ME活性与苹果酸质量分数变化趋势相反，呈负相关，2种中国樱桃果实进入转色期后苹果酸质量分数下降与NADP-ME活性迅速升高有关，果实成熟时，NADP-ME活性升高使得苹果酸开始分解，造成苹果酸质量分数下降，而2种中国樱桃果实发育后期NADP-ME活性的差异也是导致成熟时苹果酸质量分数差异的原因，与在桃、果梅和苹果等果实中NAD-MDH和PEPC调控苹果酸的合成，NADP-ME调控苹果酸分解的结果相一致[23-25]。本试验中，2种中国樱桃果实中CS活性较低，更多的OAA在NAD-MDH作用下合成苹果酸，导致柠檬酸在果实中质量分数低，但相关性分析表明2种樱桃果实中CS活性都和柠檬酸显著相关，CS是2种中国樱桃调控柠檬酸合成的关键酶，与郭润姿等[26]在苹果酸积累型果实黄冠梨中发现柠檬酸的积累与CS活性呈极显著正相关的结果相似。在2种中国樱桃果实发育的不同时期，果实有机酸积累和酸代谢酶的活性均不相同，有机酸的积累可能是多种酸代谢酶相互作用的结果，并通过影响果实内有机酸的积累，进而影响果实的风味，决定果实的品质。

4 结 论

‘黑樱桃’和‘红樱桃’2种中国樱桃果实有机酸以苹果酸，柠檬酸和奎宁酸为主，其中苹果酸质量分数远高于其他有机酸，在发育期内呈先升高后降低的变化趋势，成熟时‘黑樱桃’果实有机酸质量分数低于‘红樱桃’。花后30 d进入转色期为2种中国樱桃果实发育的关键时期，进入转色期后果实有机酸质量分数开始迅速降低。NAD-MDH、PEPC和NADP-ME是2种中国樱桃苹果酸代谢的关键酶，果实中有机酸积累不仅是各种酸代谢酶共同调控、相互作用影响有机酸的组分和质量分数，还可能与其他因素有关。