HPLC同步测定麸炒枳壳配方颗粒特征图谱与柚皮苷 橙皮苷 新橙皮苷含量△

姚娜，黄燕明，李雪银，陈桂生，康志英，2

1.广州市香雪制药股份有限公司，广东 广州 510663；2.宁夏隆德县六盘山中药资源开发有限公司，宁夏 固原 756300

麸炒枳壳配方颗粒是以麸炒枳壳饮片为原料，经过水提、真空浓缩之后将浓缩液干燥成提取物，将提取物加适量辅料制备成颗粒后进行包装制备而成。原料麸炒枳壳为枳壳经炮制后加工制成。生枳壳具有理气宽中、行滞消胀的功能，临床上用于胸胁气滞、胀满疼痛、食积不化、痰饮内停、脏器下垂，麸炒后增强了健脾消胀作用[1-2]。枳壳中包含挥发油、黄酮类、少量香豆素及生物碱等[3-4]，其中柚皮苷、新橙皮苷和橙皮苷是主要的有效成分。生枳壳经炮制后，柚皮苷、新橙皮苷和橙皮苷含量会有显著变化[5-9]。已有文献大多是单独测定枳壳或麸炒枳壳饮片及其复方制剂的主成分含量，该方法不能同时适用于指纹图谱，且关于麸炒枳壳中药配方颗粒的质量标准也尚未统一。为了有效控制和评价麸炒枳壳制备而来的配方颗粒产品的质量，本研究利用HPLC建立同步测定麸炒枳壳配方颗粒特征图谱和定量检测指标成分柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的方法[10-18]。

1 材料

1.1 仪器

超纯水器(Simplicity，美国密理博Millipore公司)；超声机(KQ500DE，昆山市超声仪器有限公司)；Ultimate 3000 DGLC高效液相色谱仪；Agilent 1260高效液相色谱仪；十万分之一电子分析天平(MS205DU，瑞士Mettler toledo公司)。

1.2 试药

枳壳对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：120981-201104，规格：0.5 g/瓶)；柚皮苷(中国食品药品检定研究院，批号：110722-201312，纯度：94.7%)；新橙皮苷(中国食品药品检定研究院，批号：111857-201102，纯度：99.6%)；橙皮苷(中国食品药品检验研究院，批号：110721-201316，纯度：95.3%)；乙腈和磷酸色谱级；甲醇分析纯。

10批颗粒成品均来自广州市香雪制药股份有限公司(批号分别为201806001～201806010)。

2 方法和结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

使用C18色谱柱；以乙腈为流动相A，水(用磷酸调节pH值至3)为流动相B，0～20 min，流动相A为22%、流动相B为78%，20～30 min，流动相A为22%～90%，流动相B为78%～10%；波长为283 nm。理论塔板数以柚皮苷峰计，不低于3000。

2.2 对照品溶液的制备

取柚皮苷、新橙皮苷和橙皮苷对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成混合对照品溶液，其中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷质量浓度分别为80、4、40 μg·mL-1。

2.3 供试品溶液的制备

取成品约0.1 g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，并加入50%甲醇100 mL，称质量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)15 min，冷却后再称质量，用50%甲醇补回减失质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 测定法

对照品溶液与供试品溶液进样各10 μL，记录色谱图。

2.5 测定结果

10批麸炒枳壳配方颗粒的柚皮苷质量分数为83.12～86.04 mg·g-1，平均质量分数为84.48 mg·g-1，橙皮苷质量分数为3.683～4.761 mg·g-1，平均质量分数为4.133 mg·g-1，新橙皮苷质量分数为46.00～47.61 mg·g-1，平均质量分数为46.73 mg·g-1；10批麸炒枳壳配方颗粒指纹图谱中有5个色谱峰能稳定重现，故确立了5个特征峰，其中2号峰鉴定为柚皮苷，3号峰鉴定为橙皮苷，4号峰鉴定为新橙皮苷。

注：2.柚皮苷；3.橙皮苷；4.新橙皮苷。图1 10个批次麸炒枳壳配方颗粒成品HPLC叠加图

2.6 方法学考察

2.6.1 专属性试验 取配方颗粒成品、麦芽糊精及枳壳对照药材分别按2.3项下方法制备，按2.1项下的色谱条件测定，结果表明，5个共有色谱峰的鉴定均不受溶剂及辅料等因素干扰，方法专属性良好。

注：A.空白溶剂；B.枳壳对照药材；C.辅料；D.麸炒枳壳配方颗粒成品；2.柚皮苷；3.橙皮苷；4.新橙皮苷。图2 麸炒枳壳配方颗粒成品特征图谱专属性试验

2.6.2 精密度试验 取同一批麸炒枳壳配方颗粒制备的供试品溶液，按2.1项下的色谱条件于高效液相色谱仪上连续进样6次，记录色谱图。以2号峰柚皮苷峰为参照，计算相对保留时间，结果其RSD值为0.00%～0.16%，各主要色谱峰的相对保留时间基本无差异，表明仪器精密度良好。

2.6.3 重复性试验 取同一个批次的麸炒枳壳配方颗粒样品，平行6份，按2.3项下方法制备，按2.1项下方法分别进样，记录色谱图。以2号峰柚皮苷峰为参照，计算各图谱的相对保留时间，RSD值为0.00%～0.11%，表明方法的重复性良好。

2.6.4 稳定性试验 取某一批麸炒枳壳配方颗粒供试品溶液，按2.1项下方法，分别在0、2、4、6、8、12、29、48 h进样，记录色谱图。以2号峰柚皮苷峰为参照，计算相对保留时间，各图谱特征峰相对保留时间的RSD值为0.00%～0.96%，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.6.5 中间精密度试验 分别考察不同分析人员、不同日期、不同设备对精密度的影响，结果RAD在0.00%～0.87%，表明该方法精密度良好。

2.6.6 耐用性试验 取同一批麸炒枳壳配方颗粒供试品，分别使用Agilent Zorbax Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Elite Hypersil ODS2(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Welch Ultimate XB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)3种型号的色谱柱测定，记录色谱图。以2号峰柚皮苷峰为参照，RSD<3.28%，表明该方法耐用性良好。

2.6.7 相对保留时间规定值的确立 经不同色谱柱及不同设备考察，供试品的色谱图中柚皮苷峰与相应的参照物峰保留时间相同，以柚皮苷峰为S峰，计算特征峰1、3、4、5的相对保留时间，根据不同条件相对保留时间变化情况确定规定值情况如下：峰1为0.85、峰3为1.09、峰4为1.30、峰5为2.00，且偏差控制在±5%以内。

2.7 含量测定方法学考察

2.7.1 线性关系及范围 取混合对照品溶液(柚皮苷：77.65 μg·mL-1，橙皮苷：3.869 μg·mL-1，新橙皮苷：42.51 μg·mL-1)，采用自动进样器分别进样0.5、1、2、5、10、15、20 μL，柚皮苷进样量为0.038 8、0.077 6、0.155 3、0.388 2、0.776 5、1.164 8、1.553 0 μg，在283 nm下测定，以柚皮苷峰面积积分值对柚皮苷对照品的进样量进行回归分析，其回归方程为：Y=21.8X-0.013，r=1，结果表明柚皮苷在0.038 8～1.553 0 μg，与峰面积呈良好线性关系。橙皮苷进样量为0.001 9、0.003 9、0.007 7、0.019 3、0.038 7、0.058 0、0.077 4 μg，在283 nm下测定，以橙皮苷峰面积积分值对橙皮苷对照品的进样量进行回归分析，其回归方程为：Y=21.792X-0.010 4，r=0.999 9，结果表明橙皮苷在0.001 9～0.077 4 μg，峰面积呈良好线性关系；新橙皮苷进样量为0.021 2、0.042 5、0.085、0.212 6、0.425 1、0.637 6、0.850 2 μg，在283 nm下测定，以新橙皮苷峰面积积分值对新橙皮苷对照品的进样量进行回归分析，其回归方程为：Y=23.909X-0.017，r=1，结果表明，新橙皮苷在0.021 2～0.850 2 μg，浓度与峰面积呈良好线性关系。

2.7.2 重复性试验 同2.6.3项下，并对所得数据进行处理，柚皮苷平均质量分数为84.30 mg·g-1，RSD为1.29%；橙皮苷平均质量分数为3.68 mg·g-1，RSD为1.01%；新橙皮苷平均质量分数为46.46 mg·g-1，RSD为1.15%，结果表明该方法重复性良好。

2.7.3 稳定性试验 同2.6.4项下，对所得峰面积数据进行处理并计算RSD。柚皮苷对照品溶液和供试品溶液的RSD分别为0.29%、0.31%；橙皮苷对照品溶液和供试品溶液的RSD分别为1.85%、0.32%；新橙皮苷对照品溶液和供试品溶液的RSD分别为0.20%、0.37%，表明麸炒枳壳配方颗粒供试品溶液及柚皮苷、新橙皮苷以及橙皮苷对照品溶液在48 h内稳定性良好。

2.7.4 加样回收率 精密称取已测柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量的麸炒枳壳配方颗粒适量，平行9份，分别精密加入低、中、高浓度的柚皮苷、新橙皮苷和橙皮苷对照品，按供试品项下操作，依法测定，平均回收率分别为98.86%、99.21%、99.66%，RSD分别为2.11%、2.21%、1.52%，结果表明该方法回收率良好。

2.7.5 中间精密度试验 同2.6.5项下，柚皮苷、新橙皮苷和橙皮苷含量的RAD在0.01%～1.83%，表明该方法中间精密度良好。

2.7.6 耐用性试验 同2.6.6项下测定，柚皮苷、新橙皮苷和橙皮苷含量的RSD为0.67%～2.09%，表明该方法耐用性良好。

3 讨论

本试验对比了50%甲醇与纯甲醇作为溶剂的区别：溶剂为纯甲醇时，会引起溶剂与流动相不匹配现象，导致产生严重的前沿峰，使峰面积比正常峰面积小，为消除这种影响，对照品和供试品制备时采用50%的甲醇溶解，峰形良好，相同进样量情况下，响应值显著提高，检测更为灵敏。故研究方法采用50%甲醇作为对照品和供试品溶液配置的溶剂。

在柚皮苷、新橙皮苷和橙皮苷的含量测定中，对其定量下限进行研究。混合对照品溶液(柚皮苷质量浓度：77.65 μg·mL-1，橙皮苷质量浓度：3.869 μg·mL-1，新橙皮苷质量浓度：42.51 μg·mL-1)适量，进样0.5 μL，依法测定。橙皮苷峰信噪比约为10∶1时，柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷的进样量分别为0.038 8、0.021 2、0.001 9 μg，连续进样5次，柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷RSD依次为1.85%、1.21%、1.42%。即确定本含量测定方法的定量下限为柚皮苷0.038 8 μg、橙皮苷0.001 9 μg、新橙皮苷0.021 2 μg。

综上所述，本实验中建立HPLC能够实现同步测定麸炒枳壳配方颗粒特征图谱与柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量，且该方法经方法学验证，适用性良好，可以作为麸炒枳壳配方颗粒质量控制和评价的依据之一。