超高效液相色谱技术在食品安全检测中的应用研究进展

张敏敏

（安徽省芜湖市食品药品检验中心，安徽 芜湖 241000）

“民以食为天，食以安为先”，食品安全是消费者关注的焦点，直接影响消费者的身体健康。食品安全也是一门专门探讨在食品加工、贮存、销售等过程中确保食品卫生及食用安全、降低疾病隐患、防范食物中毒的一个跨学科领域，因此食品安全很重要[1]。食品安全既包括生产安全，也包括经营安全，既包括结果安全，也包括过程安全，既包括现实安全，也包括未来安全。食品安全是指食品无毒、无害，符合营养要求，对人体健康不造成任何急性、亚急性或慢性危害。近年来，尽管食品工业已快速发展，食品安全管理也在不断加强，但我国的食品安全仍存在不少问题。瘦肉精事件、三聚氰胺事件、苏丹红事件、孔雀石绿事件及目前的非洲猪瘟事件等让消费者对食品安全环境堪忧，因此，对食品中具有安全隐患的因素进行快速检测成为保障食品安全的重要任务，也是为消费者的生活健康提供有力的保障。利用高效、可靠、快速的分析检测技术对食品中的非法添加物或有害物质进行检测，同时依据相应国家标准进行判定，对不合格食品及其生产厂家进行严惩，对保障食品安全具有重要意义[2]。现阶段针对食品安全检测的技术有很多，而超高效液相色谱（ultra high performance liquid chromatography，UPLC）作为一种快速、准确、高效的技术已被广泛应用在检测当中，其与质谱的联用更进一步为食品检测参数的定性和定量提供了技术支撑。

1 超高效液相色谱仪

UPLC色谱柱是由粒径小于2 μm的颗粒组成，它是一种能承受很高压力（高达150 MPa）的系统，这种色谱方法的目的是增加样本吞吐量或峰值容量[3]，在LC中减少粒度的理论优势、仪器条件的限制、高压对流动相性质的影响、高压液相色谱与UPLC的方法传递规则及UPLC生物分析、多残留筛选和代谢组学方面有一些应用。

UPLC是高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）的衍生，其基本原理是随着柱填料粒径减小，效率和分辨率增加。如果将粒径减小到小于2 μm，效率显示出显著增益，并且在流量增加时不会减小。UPLC较HPLC改进的地方主要有[4-6]：1）固定相色谱填料的差别，UPLC的色谱填料是采用杂化颗粒技术合成的高性能微粒，柱粒径为1.7 μm；HPLC常用C18色谱柱，填料粒径为5 μm；2）输液泵的差别，由于色谱柱粒径小，在使用时柱压会大大增加，UPLC输液泵需要采用耐高压的超高压输液泵；3）进样器的差别，UPLC采用压力辅助的自动进样器。UPLC基于经过验证的HPLC技术，相同条件下提供的信息远远高于HPLC，具有更高的速率、分辨率和灵敏度。此外，UPLC的分析时间和消耗的溶剂少于之前使用的色谱技术。在UPLC中，分辨率、拖尾因子和峰面积/峰值保留时间重复性等因素与HPLC相似。另外，UPLC还常同质谱仪联用，从而提高分析性能，增大离子源的离子化效率，进而提高质谱检测器的灵敏度，为化合物的定量及定性等提供极大便利[7]。

2 UPLC在食品安全检测中的应用

2.1 UPLC在乳品添加剂检测中的应用

甜味剂按其来源可分为人工合成甜味剂和天然甜味剂，安赛蜜、糖精钠、阿斯巴甜、阿力甜、纽甜和三氯蔗糖等均为人工合成甜味剂，甜菊糖苷、索马甜等为天然甜味剂。乳品添加剂是乳品生产过程涉及到的各种食品添加剂，对现代乳品工业发挥着重要作用。Moreno-González等[8]采用液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技术鉴定婴儿乳制品中15 种乳品添加剂的含量，0.05%乙酸和甲醇作为流动相，在6 min内完成分离，采用多重检测模式，在电喷雾电离正离子模式（electrospray ionization，ESI＋）下检测分析物，以获得最高灵敏度，结果表明，该方法灵敏度高、适用范围广、快速简便，适用于不同婴幼儿食品中乳化剂残留量的检测。Aguilera-Luiz等[9]采用UPLC-MS/MS简便、快速测定肉基婴儿食品和乳粉型婴儿配方中不同兽药残留，在3 个不同添加水平下分别在2 种婴儿食品基质中进行验证，得到合适的回收率和精密度（日间和日内精密度），用矩阵匹配进行量化，结果表明，该方法基于缓冲液的性质，使得提取过程快速、简便、廉价、有效、安全，无需进一步的清理步骤。Kukusamude等[10]以四丁基溴铵为离子偶联剂，以乙腈为萃取剂，建立一种离子偶联萃取法测定牛肉和牛乳样品中青霉素类抗生素（青霉素G、奥西林和氯西林）的方法，并采用HPLC进行分析，条件如下：XbridgeTMC18反相柱、等压洗脱、紫外检测波长215 nm、流动相选用磷酸盐缓冲液（pH值6.6）和25%乙腈、流速为1 mg/mL，3 种青霉素的分离在10 min之内就完成了。

Schmidt等[11]建立UPLC测定牛乳制品中VB1活性成分的方法，包括牛乳中的硫胺素、单磷酸盐硫胺素和二磷酸硫胺素，为了维持天然VB1磷酯，样品制备至关重要。比较各种酸、常用酶及其混合物的效果。采用标准品验证方法的准确性，并与相应的欧洲标准化委员会（Comité Européen de Normalisation，CEN）方法进行比较，结果表明，牛乳样品中含有大量的单磷酸盐硫胺素，占商品牛乳中VB1总含量的53.9%，原料牛乳中VB1含量高达78%。此外，单头奶牛牛乳中VB1的总含量也有很大变化，含量范围为0.24～0.54 mg/L。2.2 UPLC在食品添加剂检测中的应用

食品添加剂包括防腐剂、合成着色剂、甜味剂等，在调控食品的色泽、香气、味道及食品贮藏方面具有重要作用。我国制定了相关规定及标准，对食品添加剂的使用量及类型做出了具体的规定。然而，部分不法商家为了过分追求产品的外观及延长保质期，在生产中使用过量的合法添加剂，或者使用具有危害作用的非法添加剂，利用UPLC方法快速检测这些添加剂已有报道。

Rubert等[12]使用一种快捷、方便、便宜、有效和提取安全的UPLC-MS/MS法，成功开发和验证分析26 种化合物，它们可以用于不同疾病（如治疗厌食、用作兴奋剂、抗焦虑药、抗抑郁药和泻药）的治疗，这些化合物都是容易被非法添加到减肥食品补充剂中的物质。内标法标记化合物在5～1 000 μg/L的线性范围内呈现良好的线性关系，这取决于化合物和良好的灵敏度。张剑锋等[13]建立利用UPLC方法检测饮料中山梨酸等5 种添加剂的方法，饮料直接加水后，经C18柱分离（BEH，2.1 mm×100 mm，1.7 μm），在225 nm波长处检测，结果表明，在线性范围内，样品中的5 种物质回收率达95.5%～100.2%，相对标准偏差为1.0%～3.1%。凌云等[14]利用UPLC和质谱联用的方法检测调味料中的山梨酸等11 种防腐剂和丁基羟基茴香醚（butylated hydroxyanisole，BHA）、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol，BHT）等6 种抗氧化剂，样品经饱和NaCl水溶液稀释混合，乙腈提取，正己烷液-液萃取净化，提取液经C18反相色谱柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）分离，流动相为20 mmol/L乙酸铵水溶液＋乙腈，梯度洗脱，以ESI-、多反应监测模式进行检测，结果表明，11 种防腐剂和6 种抗氧化剂在线性范围内均具有良好的线性关系，相关系数r≥0.995 5，定量限可达0.05～5.00 mg/kg，回收率为79.7%～118.0%，相对标准偏差为0.57%～13.10%，该方法较国家标准方法简便、快速。

2.3 UPLC在非法添加物检测中的应用

非法添加物是指法律法规允许使用的添加剂之外的物质，非法添加物的使用严重危害消费者的健康[15]。毛江胜等[16]建立UPLC-MS检测辣椒中苏丹红Ⅰ-Ⅳ的方法，样品首先利用正己烷提取，使用Sep-Pak Alumina B固相萃取柱净化，再利用C18色谱柱（Waters BEH，50 mm×2.1 mm，1.7 μm）分离，流动相采用0.1%甲酸-乙腈溶液和0.1%甲酸水溶液进行梯度洗脱，苏丹红Ⅰ-Ⅳ的检出限为0.05 ng/mL，标准品回收率达到83.8%～99.0%。三聚氰胺是乳品、鸡蛋加工中的非法添加物，胡梅等[17]建立UPLC-MS/MS快速检测鸡蛋加工中三聚氰胺的方法，三聚氰胺的检测限可达0.05 mg/kg，加标回收率为89.4%～98.3%，相对标准偏差为3.35%～6.37%；与HPLC或LC-MS检测相比，UPLC-MS/MS方法省去了固相萃取柱的净化过程，样品全部前处理过程在15 min即可完成，精密度和灵敏度均可满足检测要求。

在欧盟官方的监控项目下，抗生素被控制在食用动物的组织中。然而，关于兽医实践中药物的过度使用，迫切需要找到一种替代死后分析抗生素的方法。利用羽毛作为非传统基质，可以在鸟类繁殖过程中控制抗生素的使用[18]。非法添加添加剂和化学污染物是突出的问题，由于高分辨质谱（high resolution mass spectrum，HRMS）的优势，LC与HRMS的结合在食品安全分析中得到越来越多的应用，但大多数相关的分析方法都是针对特定的已知化合物进行检测，对于食品中未知的有害化合物，非靶向筛选方法是一种补充方法。然而，在非目标物分析中仍存在许多挑战。最近的研究为关于样品制备、LC-HRMS概要分析、数据预处理、差异分析、鉴定不属于预定目标的未知化合物和非法添加剂[19]。

2.4 UPLC在食品污染物检测中的应用

对于食品污染物，1983年，联合国粮农组织和世界卫生组织食品添加剂法规委员会第16次会议规定：凡不是有意加入食品中，而是在生产、制造、处理、加工、填充、包装、运输和贮藏等过程中带入食品的任何物质都称为污染物，但不包括昆虫碎体、动物毛发和其他不寻常的物质；残留农药也应算是污染物。污染物可为化肥、农药、抗菌素、激素、药物和包装材料溶出物等。风险分析中对人类消费食品存在风险的危害物大体上分为以下几个部分：农药残留、兽药残留、其他来源化学污染物、生物（天然）毒素、食品添加剂及饲料添加剂[20-21]。食品生物污染主要是指细菌、微生物、寄生虫、病毒、昆虫及其分泌物的污染，这种污染相对容易处理。除了能引起食物中毒和人畜共患病的致病菌外，食物中的细菌还包括能引起食物变质的非致病菌，其可作为食物污染的标志。食品化学性污染涉及范围较广且情况复杂，主要包括来自生产、环境中的污染物，如农药、兽药等，以及食品容器、包装接触食品时溶入食品中的有害物质，滥用食品添加剂也是引起食品污染的主要来源。因此，采用有效的方法对食品中的污染物进行检测很有必要。

2.4.1 农药残留污染

农药在现代农业种植中发挥着很重要的作用，农药的合理利用可以有效提高作物的产量和减少病虫害的危害，而一旦滥用，大量的农药由于不能有效降解而残留在作物中，进而危害人们的饮食健康。

农药残留是指农药使用后一段时间内农药原生质、有毒代谢物、有机物、收获物、土壤农药残留、水体和大气中未分解的微量农药、降解物质和杂质直接或间接残留在粮食、蔬菜、水果、畜产品、水产品、土壤和水中。由于农药残留具有微量、受热易降解或失活的特性，因此其检测方法就要求更高效、简便、准确。刘永强等[22]将样品经乙腈提取、净化、洗脱，利用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（ultra-high performance liquid chromatography with quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF/MS）技术，对辣椒粉中灭多威、吡虫啉等27 种农药残留进行快速筛查，结果表明，27 种农药残留化合物在线性范围内线性关系良好，回收率达72.3%～118.9%，相对标准偏差为0.21%～12.70%，表明该方法适用于辣椒粉中多种农药残留的快速检测。李娟等[23]通过UPLC-ESI-MS/MS方法测定蔬菜、水果中27 种农药残留，该方法在多反应监测模式下测定，样品中的化学成分在20 min内完成分离。陈达炜等[24]建立UPLC-同位素稀释-HRMS法检测红葡萄酒中18 种农残的方法，选用6 种同位素内标进行内标法定量，有效克服了前处理过程及基质效应可能带来的误差，方法准确性和重现性有大幅提升。张聪等[25]利用UPLC-MS/MS法测定食品中10 种农药残留，样品通过净化、去杂、排除基质效应后上样分析，在10 min内对10 种拟除虫菊酯类化合物完成了检测，这一方法有效满足了快速检测的要求。

2.4.2 兽药残留污染

兽药残留是指对生病的动物进行用药后蓄积或存留于畜禽机体或产品（如蛋制品、乳制品、肉制品等）中的原型药物或其代谢产物，一般包括与兽药有关的杂质残留[26]。

兽药残留多是治疗动物疾病时不能准确把控，过量使用药物，致使一部分药物不能被动物吸收或是药物经动物代谢成代谢产物而存于体内，在人类食用后转移至人体。人类长期食用兽药残留超标的食品时，这些兽药残留不能被人自身代谢系统代谢，体内残留量达到一定程度时将会引发人体产生多种急、慢性中毒，或导致人类耐药菌株的产生，还可能具有致畸、致癌、致突变风险[27]。程建桥等[28]建立婴幼儿配方乳粉中17 种头孢菌素类药物残留的UPLC-MS检测方法，利用HRMS Full MS/dd-MS2扫描采集数据，发现17 种头孢菌素类药物在线性范围内线性关系良好，回收率达69.6%～91.4%，相对标准偏差均小于10%，该方法能达到快速筛查的目的。陈秋华等[29]采用UPLC-四极杆质谱法建立草鱼、虾、蟹等水产品中16 种激素残留的检测方法，结果准确性较高，为快速检测水产制品中的激素残留提供了有效的技术手段。李丽萍等[30]利用UPLC-MS/MS技术测定猪肉中6 种玉米赤霉醇类物质，采用多反应监测模式进行MS/MS检测，结果表明，目标物线性关系良好，方法重现性好，为肉制品中玉米赤霉醇类物质的快速定性和定量检测提供了参考。

2.4.3 生物毒素污染

生物毒素是由各种生物自身产生的有毒物质，即天然毒素，它是生物来源的并不可自复制的有毒化学物质，包括动物、植物、微生物产生的对其他生物物种有毒害作用的各种化学物质。

Suzuki等[31]研究高脂双壳类海洋生物毒素，以UPLCMS/MS、多离子反应监测为基础，采用时间段极性切换，建立同时测定牡蛎和贻贝中6 种腹泻性贝类毒素（5 种酸性生物毒素和1 种中性生物毒素）的灵敏、可靠的方法，研究UPLC流动相老化对腹泻性贝类中毒（diarrhetie shellfish poisoning，DSP）毒素MS检测灵敏度和保留时间漂移的影响，将所建立的方法成功应用于韩国水产市场采集的40 份牡蛎和贻贝样品中DSP毒素的定量分析。

2.5 UPLC在食品微生物代谢产物检测中的应用

微生物代谢是指微生物在生存过程中的代谢活动，微生物在代谢过程中会产生多种代谢产物，根据代谢产物与微生物生长和繁殖的关系，其可以分为初级代谢产物和次级代谢产物。初级代谢产物是微生物生长和繁殖所需的物质，次级代谢产物是生长和繁殖非必需的物质，因其复杂的微生物和化学结构没有明显的生理功能。

食品中存在着大量的微生物及其代谢产物，其中有些对人体有益，有些则对人体具有较强的致癌和致畸性。真菌毒素是一类由真菌产生的具有毒性的次级代谢产物，常见的有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮及展青霉素等，它们广泛存在于粮油及其制品、食品及饲料中。由于其具有较强的毒性和污染范围较广，已引起国际上的高度重视[32]。廉慧锋等[33]建立利用UPLC-MS法对花生、玉米、麦仁中的9 种真菌毒素进行检测的方法，线性关系良好，符合痕量分析要求，为其他基质中多种真菌毒素含量的同时测定提供了参考。叶金等[34]采用不经过柱净化而直接对样品进行提取稀释的快速前处理方法，结合稳定同位素稀释技术排除基质效应的影响，利用UPLC-四极杆/静电场轨道肼-HRMS法，对小麦中16 种真菌毒素进行快速检测，该方法可满足大量粮食样品中真菌毒素快速、准确定性及定量分析的要求。2.6 UPLC在保健食品检测中的应用

生活节奏的不断加快导致亚健康人群的扩大，人们的保健意识逐渐增强，市售保健食品也琳琅满目。有些不法商贩为了牟取暴利，向其中加入化学药品或添加剂，以达到替代有效成分的目的[35]。保健食品作为一种功能性食品，能够缓慢达到调节人体机能的作用，但不以治疗为目的，故适用于特定人群。不法商贩非法加入化学药品或添加剂，有时可能导致患者或消费者食用后与自身服用的药物作用叠加，造成机体的更大伤害，甚至可能危及生命[36]。

血糖是指存在于血液中的葡萄糖，血糖升高可能与饮食、疾病等有关。若血糖值较正常值稍高一些，未达到糖尿病的诊断标准，可以通过改变生活方式来干预。市面上降血糖的药物很多，我国已出台的降血糖非法药物检测标准已经不能满足日常监管的需求[37-39]。胡青等[40]建立UPLC-三重四极杆质谱法，在ESI＋或ESI-模式下，以多反应监测模式检测，对流动相、样品前处理、基质效应和质谱条件等进行优化，对食品中28 种降糖类非法添加物进行检测，该方法在原有标准和文献报道方法的基础上扩大了化合物的检测范围，且方法快速、准确，可以应用于日常检测，为打击非法添加行为提供了技术支撑。

肾小球滤过率（glomerular filtration rate，GFR）是在慢性肾脏疾病或其他肾脏功能相关疾病背景下评估肾功能的最重要工具之一[41]。目前，碘己醇是一个很好的GFR评估候选物质[42]，它表现出最小的蛋白结合率和最小的肾外间隙，在肾小管水平上既不分泌也不重新吸收。Martin等[43]采用微吸附采样系统提取毛细管血液中的碘己醇，提出并评价了一种新的LC-MS/MS测定方法。

肥胖症是一组常见的代谢症群。当人体进食热量多于消耗热量时，多余热量以脂肪形式贮存于体内，其量超过正常生理需要量，且达一定值时演变为肥胖症。正常男性成人脂肪组织质量占体质量的15%～18%，女性占20%～25%。随年龄增长，体脂所占比例相应增加。肥胖的评估方法包括人体测量学、双能X线吸收法、超声、CT及红外线感应法等。如无明显病因者称单纯性肥胖症，有明确病因者称为继发性肥胖症。肥胖症是目前危害身体健康的主要病症之一，减肥类保健食品成为人们的首选，而非法添加化合物对人体产生的危害远大于减肥本身[44-45]。董喆等[46]利用UPLC-四极杆/静电场轨道阱质谱法快速筛查减肥类保健品中常见的20 种非法添加药物，并对其含量进行定量分析，结果表明，20 种药物在相应的质量浓度范围内具有良好的线性关系（r＞0.995），20 种非法添加药物的检出限可达0.03～10.00 ng/mL，加标回收率为78.5%～98.6%，相对标准偏差为2.11%～9.21%，该方法对非法添加减肥药物的检测快捷、方便，为食品安全监管提供了便利。

3 结 语

UPLC因其检测的准确性、高灵敏度及分析速度快，在食品安全检测中已成为一种重要的检测工具，与MS的联用更是拓宽了UPLC的适用范围，满足了一些复杂混合物中痕量物质的分析要求。随着分析技术的不断提高，UPLC将在以后的食品安全检测实际应用中发挥更大的效力。与传统的HPLC相比，UPLC的速度、灵敏度及分离度均较优，能够缩短分析时间，同时减少溶剂用量，降低分析成本，是对化合物进行定性、定量的好工具。