金果榄种子特性及不同沙藏方式促进发芽的研究

薛襟祺　Ｍｏｈａｍｍａｄ Ｍｕｒｔａｚａ Ａｌａｍｉ　王学奎　刘三波　龚达林　王雪松

摘要：为了解金果榄（Tinospora sagittata Gagnep）种子的生理特性和萌发、生长特性，分别用鲜果实和鲜种子进行沙藏处理后，对野生金果榄果实、种子和胚形态结构进行了观察;用含5 mg/L赤霉素的MS培养基培养、沙藏2个月和4个月对金果榄种子进行无菌发芽试验。结果表明，室温（日夜温差>10 ℃）湿润沙藏可打破金果榄种子休眠，促进种子萌发，保持种子活力;赤霉素处理能快速打破种子休眠，15 d后发芽率达到80%以上;金果榄种子经风干后2个月、4个月的发芽率分别为20%和10%，表明金果榄种子不适合干燥贮藏。因此，金果榄的休眠类型主要是由于萌发抑制物存在而导致的生理休眠。

关键词：金果榄（Tinospora sagittata Gagnep）;种子休眠;沙藏;赤霉素;幼苗生长

中图分类号：S567         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）22-0134-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.22.031           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Research on seed characteristics of Tinospora capillipes Gagnep and promotion of germination under the different sand storage ways

XUE Jin-qi1，Mohammad Murtaza Alami1，WANG Xue-kui1，LIU San-bo2，GONG Da-lin2，WANG Xue-song1

（1.College of Plant Science & Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China;

2.China Resources Sanjiu （Huangshi） Pharmaceutical Co.，Ltd.，Huangshi 435000，Hubei，China）

Abstract： In order to study the seeds physiological property， germination and seedlings growth characteristics of Tinospora capillipes Gagnep， the morphological structure of fruits， seeds and embryos were observed. Fresh seeds were cultured on MS medium added 5 mg/L gibberellin （GA）， other seeds which were preserved in sand for two and four months were cultured on MS medium without plant growth regulator for germination. The results showed that sand storage of fresh fruits and seeds in room（temperature difference between day and night>10 ℃） could break the dormancy of Tinospora capillipes Gagnep， promote the germination， and keep the seed vigor. Gibberellin treatment could break the seed dormancy effectively， and the germination rate was more than 80% after 15 d. The germination rate of the air-dried seeds after 2 months and 4 months were 20% and 10%， respectively. Therefore， the seeds of Tinospora capillipes Gagnep are not suitable for storage after air-dried. In conclusion， seeds of Tinospora capillipes Gagnep have dormant characteristics mainly because of germination inhibitor in endosperm.

Key words： Tinospora capillipes Gagnep; seed dormancy; sand storage; gibberellin; seedlings growth

金果欖是防己科青牛胆属植物青牛胆（Tinospora sagittata Gagnep）或金果榄（Tinospora capillipes Gagnep）的地下球状块根，别名山慈菇、地苦胆、金狮藤。中国金果榄的基源植物主要为青牛胆、云南青牛胆和峨眉青牛胆[1]，分布在秦岭以南至中南半岛，主产于四川、贵州、广东和广西。金果榄味苦性寒，具清热解毒、通气道、调火路、清肝明目的功效[2]，也有报道表明，其“能祛内外结热，遍身恶毒，消瘴疠，止齿痛”[3]。金果榄是苗族、侗族、瑶族等少数民族的习用药物，临床上用于治疗咽喉肿痛、发炎发热和上呼吸道感染等疾病[4]。

近年来，随着金果榄药材价格的升高，野生资源遭到掠夺式采挖，其资源和生态环境遭到严重破坏。因此，为保障金果榄原料的持续供给，开展野生抚育和人工栽培是解决金果榄资源可持续发展的必由之路。由于金果榄药材长期依赖野生资源，目前对于金果榄植物的生长发育特性了解甚少。野生金果榄自然状态下结实不多，给金果榄的资源扩繁带来了较大障碍。潘丽梅等[5]和李小泉等[6]利用组织培养探索了金果榄叶腋处芽的萌芽和生根情况，对金果榄的扦插繁殖具有一定参考价值。但目前有关金果榄的有性繁殖器官种子的特征、特性了解不多，关于金果榄种子的繁殖技术研究鲜见报道。本研究以采集的野生金果榄果实为材料，探讨金果榄种子的形态特征、生理特性以及不同保存方式对其萌发的影响，以期为金果榄种苗繁育提供技术支撑。

1  材料与方法

1.1  材料

试验所用的野生金果榄果实于2017年10月在湖北省西南部山区采集，并经过实地鉴定为防己科青牛胆属植物。

1.2  试验设计

将采集的野生金果榄果实分成3份，其中1份用流水冲洗果实表面后作为鲜果备用;另外2份经揉搓去掉果皮、果肉后用流水冲洗干净，1份作为鲜种子备用，另1份装入尼龙网袋悬挂于通风处阴干，作为干种子备用。

1）金果榄鲜果和鲜种子沙藏处理。将河沙过筛后，选取直径约0.5 mm的河沙，经流水漂洗后，沥干水分至沙粒湿度达到40%左右，即手握成团、落地即散的状态。事先在长、宽、高分别为30、20、8 cm的白色塑料盆中铺设高约4 cm的湿沙，分别将金果榄鲜果和鲜种子均匀摆放在沙面上，果实和种子上面再盖上3～4 cm的湿沙。每个塑料盆上覆盖2层吸水性强的湿润毛巾，及时补充水分以保持河沙湿度。沙藏处理于2017年10月17日开始，沙藏的果实和种子置于室内自然通风条件下，沙藏鲜果的处理记为FS，沙藏鲜种子的处理记为SS，每种沙藏方式设置3次重复。7 d后每2 d观察发芽情况，记录发芽时间，并统计发芽率。

种子沙藏60 d后，移入河沙和营养土（1∶3，  V/V）的混合基质中，置于（25±2） ℃的温室中进行培养，光暗循环时间为12 h/12 h，平均光照强度  18 000 lx。分别记录相应沙藏处理下金果榄幼苗生长至一叶期、二叶期和三叶期需要的天数，用直尺测定三叶期时的株高和主根长。

2）金果榄种子无菌发芽试验。将鲜种子去掉种皮后用0.1%的氯化汞消毒3 min，接入含5 mg/L GA的MS培养基中，记为GA，在不添加GA的MS培养基上发芽作为对照（CK）;另将干藏2个月和4个月的干种子在去离子水中浸泡至恒重，去掉种皮后，分别接种在不含GA的MS培养基中进行无菌萌发试验，其处理分别记为SD2和SD4。每个培养瓶中接入20粒种子，每处理3次重复。光照培养箱中培养温度为（25±1） ℃，相对湿度为50%。

1.3  测定指标与方法

1）种子发芽率测定。沙藏处理的种子，7 d后每隔2 d观察、记录种子的发芽数，无菌萌发试验每天观察、记录种子的发芽数。种子发芽率=发芽种子数/供试种子数×100%。

2）金果榄果实和种子形态特征观察。取鲜果和鲜种子，在体式显微镜下观察果皮、种皮形态，将种子切削后观察种仁和胚的形态特征。

3）金果榄种子吸水特性测定。将风干种子分成2组，1组保留完整种皮（有种皮），另1组剥去外种皮（去种皮），各取完整种子20粒，称其总质量后，放入烧杯中，加入相当于种子质量10倍的去离子水，置于25 ℃的培养箱中，间隔2 h取出，用吸水纸吸干种子表面水分后称其总质量，计算种子不同时间下的吸水百分率，各3次重复。

4）株高和根长测定。用直尺测定株高和根长，株高为根茎连接处到顶芽的高度，根长为根茎连接处到主根末端的长度。

1.4  数据统计和分析

采用Excel 2017软件进行数据统计和分析。

2  结果和分析

2.1  金果榄果实和种子的形态特征

野生金果榄的果实生长在叶腋处，果实球形，有果柄，成熟时粉红色，从果实着生情况可见其花序为总状花序（图1a）。金果榄果实为核果，果皮薄，果肉多汁，具甜味。果实球形，成熟果皮粉红、表面光滑、有光泽，平均直径为8.5 mm（图1b）。去除果皮、果肉后，金果榄种子呈半球形，直径约为5.7 mm，腹面向内凹陷（图1c）。金果榄种子的鲜、干质量分别为每千粒53.20、40.36 g，可见成熟后的金果榄鲜种子含水率相对较低，为24.14%。外种皮革质化，表面有点状凸起，背面脊线为种脊，种子一端隆起（图1d）。将种子纵切后，可以看到种子结构从内到外依次是外种皮（革质）、内种皮（膜质）、胚乳和胚，胚根、胚轴和子叶可明显看到，而胚芽不明显，整个胚嵌合在胚乳中间，胚根在胚乳有尖状凸起的一端（图1e）。将外种皮去掉后，内表皮膜质，薄且透明，胚乳白色（图1f），腹部有明显凹陷（图1g）。将金果榄外层胚乳去除，可以看到具有两片子叶，中部部分重疊，紧贴在胚乳上，与胚轴相连（图1h）。

2.2  金果榄种子的吸水特性

图2为干燥的金果榄完整种子和去种皮种子在25 ℃下的吸水量曲线。整体来看，金果榄去种皮种子的吸水量明显大于有种皮的完整种子，在57 h内的吸水量达到62%，比完整种子此时的吸水量46%相对增加了16个百分点。而在浸种的最初4 h内，有种皮的完整金果榄种子的吸水量明显高于去种皮的，但这一时期的总吸水量不高，小于10%;浸种4 h之后，去种皮的金果榄种子的吸水量明显高于完整种子，浸种47 h后，两者的吸水量均达到最大值，一直到浸种后57 h，吸水量曲线均呈直线，显示此时期为干燥金果榄种子的吸水停滞期。

从有、无种皮的金果榄种子浸种到吸水停滞期的出现均需要约47 h，一方面说明金果榄种子吸水较慢，另一方面表明金果榄种子的革质化种皮虽然坚硬，但透水性并不差。有种皮的完整种子在浸种初期（4 h内）吸水量和吸水速度高于去种皮的种子，与其种皮的亲水力有关，一方面是干燥种皮吸水较快，起到软化种皮的作用，另一方面是短时间水分充满干种子外种皮和内种皮之间的间隙;而浸种4 h之后完整种子的吸水量和吸水速率明显低于去种皮的，反映出金果榄种子的坚硬种皮影响其胚乳吸水。达到吸水停滞期时，去种皮种子吸水量约为完整种子的1.3倍，说明革质化种皮在一定程度上阻碍了种子吸水。

2.3  沙藏对金果榄果实和种子萌发及幼苗生长的影响

由表1可知，金果榄鲜果沙藏处理（FS）的发芽时间，达到一叶期、二叶期和三叶期的时间均晚于鲜种子沙藏处理（SS），分别晚6.2、5.1、9.2、11.2 d，差异均显著。鲜果沙藏处理的发芽率比鲜种子沙藏的高，两者之间的差异显著。从幼苗的生长量来看，鲜果沙藏处理的幼苗在三叶期时株高和主根长均小于鲜种子沙藏处理，分别只有种子沙藏处理的68.4%和79.0%，差异均显著。

图3a和图3b分别为金果榄鲜果和鲜种子沙藏50 d的形态。两者胚根长度相比，金果榄鲜种子沙藏的发芽速度明显快于鲜果沙藏。金果榄种子萌发时胚根首先突破种皮，进行伸长生长（图3a）;胚根伸长到一定程度时，胚芽从胚轴与子叶连接处伸出（图3b）。图3c和图3d分别为鲜果和鲜种子沙藏60 d后，再移栽至温室生长80 d后的幼苗。可以看到，金果榄幼苗在二叶期时种子尚未掉落（图3c），属于子叶留土植物。三叶期时种子已经脱落（图3d），幼苗完全进入自养阶段，因此，三叶期是金果榄幼苗由异养转入自养的时期。鲜种子沙藏后，其萌发形成的金果榄幼苗的叶片数、株高和根长均大于鲜果沙藏处理。由此可见，成熟的金果榄果实以去果皮、果肉后的新鲜种子进行沙藏处理，种子萌发快，幼苗生长更为迅速。从金果榄种子胚根伸出到幼苗第一片真叶展开所需时间约为45 d，胚芽在胚根伸长到1～2 cm之后伸出（图3b），表明胚芽伸长和出土所需时间较长。

2.4  金果榄干、鲜种子在无菌条件下的萌发特性

由图4可知，在含有5 mg/L GA的MS培养基上，金果榄鲜种子的发芽率达到80%以上，没有添加GA作为对照的种子发芽率只有20%;干藏2个月、4个月后的金果榄种子在MS培养基上发芽率分别为20%和10%。在无菌萌发试验中，与对照相比，GA处理可明显提高金果榄种子的发芽率，比不添加GA的种子发芽率高4倍。

在培养过程中，发现添加GA后，种子培养8 d后开始萌发，15 d后发芽率达到75%，而对照（CK）在培养9 d后种子开始萌发，15 d后发芽率仅为20%，表明GA能明显提高金果榄种子萌发的速度和整齐度。

3  讨论

通常药用植物的种子具有不同程度的休眠，有利于适应野外的不良环境，以保证在野生环境下物种种群数量的延续[7]。然而，野生植物的休眠造成了野生资源人工开发和利用的困难，而且若种子保存不当，则导致种子活力降低，甚至完全丧失生活力。

形态观察结果表明，金果榄种子结构类似于蓖麻种子，属双子叶有胚乳种子，具有两层种皮，外种皮革质化，内种皮膜状，胚包裹在胚乳之间，子叶膜质并与胚乳贴合在一起，是植物界中少见的类型。成熟金果榄种子的胚基本发育完全，但胚芽很小，不能明显看到，隐藏在胚轴与子叶连接处。彭木等[8]使用不同温度（4、25、60、80 ℃），不同药剂（6-BA、NAA、GA、HgCl2）对蓖麻种子进行处理，发现4 ℃和50 mg/L GA处理后，其发芽率分别达到71.6%和90.0%，与本试验得到的结论相似。

本试验比较了自然条件下湿润沙藏和干藏2种贮藏方式对金果榄种子萌发的影响。结果发现，金果榄完整鲜果以及去除果皮果肉后的新鲜种子经沙藏后的发芽率均超过85%，而种子风干后保存2个月、4个月后的发芽率只有20%和10%。因此，金果榄种子采收后应及时沙藏，以确保发芽率。胡茶青[9]研究发现，青钱柳种子室外沙藏发芽率为94%，干藏后仅为49%。湿润沙藏也适用于玉竹[10]、黄檗[11]等其他药用植物种子的保存。

沙藏过程中，温度条件对种子萌发影响较大。在本试验中，金果榄种子的沙藏过程在自然条件下完成，沙藏期间的昼夜温差大于10 ℃，能保持金果榄种子的良好活力。张国珍等[12]研究发现，凹叶厚朴种子在自然条件沙藏的发芽率（98.4%）远高于低温冷藏（34.0%）。本试验因采集的种子数量有限，未进行梯度恒温试验，有待后续研究。此外，本试验结果发现，鲜果沙藏处理的发芽率高于种子沙藏，但种子沙藏处理的平均发芽时间比鲜果沙藏处理的短6.2 d。这与王占红等[13]对黄精种子进行沙藏处理的结果相似。说明保留金果榄果实的果肉有利于保证其种子的发芽率，但种子的平均发芽时间会延长一周左右。金果榄种子胚根伸出较长时，胚芽才开始伸长，从发芽到幼苗一片真叶展开所经历的时间超过40 d，可能与金果榄种子的胚芽小或是胚芽未完全发育有关。

赤霉素是打破种子形态休眠和生理休眠的常用调节剂。刘恒等[14]用100 mg/L的赤霉素处理金银花种子12 h，显著提高了金銀花种子的发芽率。苗利娟等[15]用100 mg/L的赤霉素处理怀山药零余子，有效破除了休眠。本试验表明，赤霉素能够显著提高金果榄种子的发芽率和萌发整齐度，一方面可能是解除了萌发抑制物的抑制作用，并促进胚根迅速伸长，另一方面可能是赤霉素诱导降解胚乳养分有关酶的合成，促进了胚对营养物质的吸收，促使种子胚芽的发育。因此，金果榄种子的休眠类型主要为生理休眠类型，可能也存在因胚芽未发育完全有关的形态休眠。

通过沙藏或赤霉素处理2种方式可以有效破除金果榄种子的休眠，且赤霉素打破其休眠的速度更快。金果榄种皮不阻碍种子对水分的吸收，但其革质化的外种皮对种子的后期吸水有阻碍作用。因此，金果榄休眠类型主要为萌发抑制物引起的生理型休眠。

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