HGF/c-met 信号通路对乳腺癌上皮-间充质转化的影响研究△

刘海旺，张宏旭，刘燃，郝美玲，王军，李春辉

承德医学院附属医院1病理科，2乳腺外科，3麻醉科，河北 承德 067000

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，每年新发病例超过150万例，造成约50万例患者死亡[1]。然而乳腺癌发生和发展的分子机制复杂，仍不是十分清楚。肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）是一种由间质细胞分泌的多功能生长因子，由两个亚基组成，是含有728个氨基酸的肝素结合糖蛋白[2]。c-met是原癌基因met编码的蛋白质产物，其目前已知的唯一天然配体是HGF，故也被称为HGF受体，属于受体酪氨酸激酶家族[3]，HGF与cmet结合可以激活酪氨酸激酶活性，在肝癌、小细胞肺癌、胃癌及卵巢癌等多种癌症中被证实具有较强的诱导上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、血管生成，促进肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭等作用[4]。目前以经其他通路诱导的乳腺癌EMT研究较多[5]，而HGF/c-met信号通路对乳腺癌EMT影响的研究较少。本研究拟通过对HGF、c-met及乳腺癌EMT相关蛋白的检测，探讨HGF/c-met信号通路与乳腺癌EMT的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2017年1月至2018年12月于承德医学院附属医院进行乳腺癌或乳腺纤维腺瘤切除患者的病历资料。纳入标准：①所有患者经术后病理检查明确诊断，为乳腺癌或乳腺纤维腺瘤；②患者临床资料和病理资料记录规范、准确、完整；③未合并其他肿瘤或有肿瘤史。排除标准：①乳腺癌复发者；②弥漫性病变、留取标本不合格者。根据纳入、排除标准，本研究共纳入80例乳腺癌及80例乳腺纤维腺瘤切除患者。所有患者均为女性，乳腺癌组中，年龄38～64岁，平均（51.26±5.15）岁；乳腺纤维腺瘤组中，年龄35～62岁，平均（48.93±5.82）岁。两组患者年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经医院伦理委员会审查并通过。选取80例乳腺癌患者和80例纤维腺瘤患者的手术标本进行研究，分别作为乳腺癌组及纤维腺瘤组，另选取乳腺癌组患者对应的正常乳腺组织（肿瘤边缘＞5 cm区域）作为正常乳腺组（80例）。

1.2 检测指标及试剂

检测所有标本的6种蛋白指标，分别为HGF、c-met、上皮钙黏素（E-cadherin）、β-联蛋白（β-catenin）、Vimentin及Snail。所有免疫组化试剂盒均购自上海研生实业有限公司。

1.3 免疫组化检测方法

所有操作严格按照本实验室标准化操作流程，由2名经验丰富的病理科医师进行。①内源性过氧化酶灭活：标本石蜡包埋连续切片4 μm，3%H2O2室温孵育10 min；②抗原修复：切片用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）冲洗5 min，再放入0.01 mol/L（pH值为6.0）的枸橼酸盐缓冲液中置于微波炉10 min；③封闭：加入正常山羊血清工作液，37℃湿盒温育60 min；④一抗：滴加鼠抗抗体（一抗），37℃湿盒中孵育60 min，在湿盒中4℃过夜；⑤二抗：PBS冲洗5 min，重复3次，滴加酶标羊抗鼠免疫球蛋白G（IgG）聚合物（二抗），室温孵育15 min，再次用PBS冲洗切片3次，每次5 min；⑥显色：滴加二氨基联苯胺显色，苏木素复染核3 min，树胶封片，观察。每批实验设置阴性对照（组织切片用PBS替代一抗，其余染色步骤相同）和阳性对照（厂家提供的阳性切片）。

1.4 结果判定标准

结果判读由2名经验丰富的病理科副主任医师独立进行，当结果不一致时再重复判读或由上级医师阅片判定。所有待检测蛋白均以待检细胞的细胞质或细胞核出现棕黄色颗粒为阳性，阳性表达强弱判断标准按阳性细胞百分比及着色强度评价。①阳性细胞百分比：选择染色均匀的肿瘤区域，在400倍视野下计数阳性细胞占视野细胞总数的百分比，共计数5个视野，取平均值，无阳性细胞为0分，＜25%为1分，26%～50%为2分，＞50%为3分。②着色强度：不着色为0分，着色弱为1分，中等着色为2分，着色强为3分。阳性细胞百分比评分与着色强度评分相加为总评分，0分为阴性（-），1～2分为弱阳性（+），3～4分为中度阳性（++），5～6分为强阳性（+++）。其中c-met强阳性（+++）作为c-met高表达，其余为c-met低表达。

1.5 统计学处理

采用SPSS 20.0统计软件进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组比较采用t检验，3组比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用SNK-q检验；计数资料以例数及率（%）表示，组间比较采用χ2检验或连续校正法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.13 组组织中6种蛋白表达量的比较

3组组织中HGF、c-met、E-cadherin、β-catenin、Vimentin、Snail表达量比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）；乳腺癌组组织中HGF、c-met、Vimentin、Snail表达量均高于纤维腺瘤组及正常乳腺组，E-cadherin、β-catenin表达量均低于纤维腺瘤组及正常乳腺组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；正常乳腺组HGF表达量高于纤维腺瘤组，差异有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

表1 3组组织中6种蛋白表达量的比较

2.2 乳腺癌组织中c-met 高表达与低表达患者临床特征的比较

c-met高表达患者发生淋巴结转移、TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、分化程度为低分化的比例均高于c-met低表达患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）；c-met高表达与低表达患者年龄、原发灶长径、雌激素受体及新辅助化疗比例比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表2）

表2 乳腺癌组织中c-met高表达与低表达患者临床特征的比较

2.3 乳腺癌组织中c-met 高表达与低表达患者EMT 相关蛋白表达量的比较

c-met高表达患者E-cadherin和β-catenin表达量均明显低于c-met低表达患者，Vimentin和Snail表达量均明显高于c-met低表达患者，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表3）

表3 乳腺癌组织中c-met高表达与低表达患者EMT相关蛋白表达量的比较（±s）

表3 乳腺癌组织中c-met高表达与低表达患者EMT相关蛋白表达量的比较（±s）

分层E-cadherin β-catenin Vimentin Snail c-met高表达（n=56）c-met低表达（n=24）t值P值4.11±0.35 4.91±0.38 9.131 0.000 4.30±0.56 4.77±0.53 3.494 0.001 3.58±0.52 2.31±0.49 10.180 0.000 3.82±0.47 2.29±0.36 14.239 0.000

3 讨论

肿瘤发病机制十分复杂，涉及的分子众多，一直是各国学者研究的热点。从分子水平上解析乳腺癌的发病机制，是发现新治疗靶点的一个重要途径[6]。EMT是上皮来源的恶性肿瘤中广泛存在的一种分子病理改变，它使上皮源性肿瘤细胞的上皮标志物表达下调，并获得间质细胞表型，从而得到更强的侵袭和转移能力[7]。EMT的诱导机制较为复杂，据文献报道，多种信号通路均对乳腺癌EMT过程有一定的影响，而HGF/c-met信号通路与乳腺癌EMT的关系研究报道较少[8-11]。

本研究结果显示，乳腺癌组HGF、c-met表达量均高于纤维腺瘤组及正常乳腺组，提示HGF/c-met信号通路在乳腺癌中表达上调。而正常乳腺组HGF表达量高于纤维腺瘤组，这与Veenstra等[12]的实验结果不符。可能是由于本研究正常乳腺组取材于癌灶附近，而HGF在正常生理状态下于全身各处都有表达，主要由间充质细胞以自分泌和旁分泌的方式表达、起效[13]，从而使本研究中的正常乳腺组中HGF/c-met表达偏高。

另外本研究选择了4种EMT相关蛋白，其中E-cadherin和β-catenin是上皮细胞间典型的黏附分子，细胞骨架肌动蛋白之间的连接者。Sommerova等[14]研究表明，当E-cadherin表达下调时，E-cadherin/β-catenin复合体不稳定并解离，上皮间黏附力减弱，同时β-catenin可从膜上释放入细胞质，激活Wnt信号通路诱导肿瘤细胞出现EMT的相关改变。本研究结果显示，乳腺癌组织中E-cadherin和β-catenin表达量均低于纤维腺瘤组及正常乳腺组。Vimentin是间质细胞的特征性成分，其通常不表达在上皮细胞中，是肿瘤EMT常见的指标[15]。Snail是一种锌指蛋白，其通过下调E-cadherin等上皮细胞标志物和上调间质细胞标志物的表达，极大地促进肿瘤细胞EMT[16]。本研究结果显示，乳腺癌组织中Vimentin和Snail表达量均高于纤维腺瘤组及正常乳腺组，提示乳腺癌细胞存在EMT倾向。

本研究结果显示，c-met高表达患者E-cadherin和β-catenin表达量均明显低于c-met低表达患者，提示c-met高表达患者的肿瘤细胞可能具有更高的侵袭和转移能力。另外，c-met高表达患者Vimentin和Snail表达量均明显高于c-met低表达患者，提示c-met高表达患者的肿瘤细胞具有更多的间充质细胞特征，其EMT的程度更高。从本研究的临床特征分析，c-met高表达患者发生淋巴结转移、TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、分化程度为低分化的比例均高于c-met低表达患者，这与李树斌和张延新[17]的研究结果类似。而低分化的乳腺癌组织间充质特征更加明显，EMT程度更高，淋巴结转移和远处转移的风险更高[18]，TNM分期就更高，这与结果中EMT相关蛋白表达量的结果吻合。提示，c-met高表达可能与肿瘤细胞的转移、扩散行为有关[19]。

本研究采用免疫组化法对上述蛋白进行检测，具有一定的局限性，只能对HGF/c-met信号通路与乳腺癌EMT的关系做一初步研究猜想。仍需要Western blott等更精确的方法进行定量，以及细胞实验对HGF/c-met信号通路与乳腺癌细胞侵袭和转移能力影响的直接观察。

综上所述，HGF/c-met信号通路可能通过下调上皮黏附分子、上调间充质分子标志物的表达，促进乳腺癌细胞EMT。