survivin基因表达与胃癌患者对奥沙利铂耐药的关系分析

国 强 白雪峰 周勇慧

胃癌始终是危害我国居民身心健康的常见恶性肿瘤。目前，普外科手术是治疗早期胃癌的重要手段，但其难以控制残留的癌细胞局部再生长，且临床中多数患者确诊时已为进展期胃癌，接受普外科手术治疗同时往往需辅以化疗、放疗等其他综合性治疗手段，尤其是化疗已经成为多数进展期胃癌患者治疗必不可少的环节[1]。作为新型的第三代铂类化疗药物，近年来奥沙利铂治疗进展期胃癌的良好效果已取得广泛关注，但肿瘤多药耐药性的存在成为了阻碍奥沙利铂化疗效果的重要因素[2]。迄今为止，胃癌的多药耐药性机制尚未完全明确。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的成员之一，既往研究[3-4]发现其能够促进血管生成，影响多种肿瘤的病理特征，也与耐药形成有关。因此，明确胃癌组织survivin基因表达与奥沙利铂耐药性的关系对预测患者化疗效果有重要意义。

1 材料与方法

1.1 临床标本

原发性胃癌标本来源于2016年6月至2018年3月经包头市肿瘤医院病理确诊且行普外科手术切除的80例胃癌患者，其中有36例取得距离癌组织边界>3 cm的癌旁组织标本(术后证实无肿瘤细胞存在)；所有标本均经甲醛固定，常规石蜡包埋、切片，然后经苏木精-伊红染色进行病理诊断。所有患者的病理标本检查明确诊断为腺癌，并符合中华人民共和国卫生部制定的《中华人民共和国卫生行业标准：胃癌诊断标准(WS 316-2010)》[5]中相关诊断标准，术前未接受任何身体耐受相关药物化疗，未合并其他恶性肿瘤，临床各项资料完善。80例中，男性51例(63.75%)，女性29例(36.25%)，年龄36～69岁，平均(54.08±10.14)岁，其中贲门癌、胃体癌、胃窦癌分别为35例、35例、10例。

1.2 方法

1.2.1 主要仪器、药物及试剂 封片机购自德国Leica公司；离心机购自美国波德BIRD公司；显微镜购自日本NIKON公司。奥沙利铂购自江苏恒瑞医药股份有限公司；Survivin兔抗人多克隆抗体购自美国Zymed公司；SP免疫组织化学染色试剂盒、加强型二氨基联苯胺(DAB)显色试剂购自福州迈新生物技术开发公司。

1.2.2 免疫组化染色及结果判定 采用免疫组化染色SP法。用磷酸盐缓冲洗液(PBS)代替一抗作阴性对照，用已知阳性胃癌切片作为阳性对照，采用两步法进行，依次加一抗、加二抗进行孵化，最后以DAB显色，苏木精复染，进行相应处理后封片，于10×40倍光镜下观察10个阳性细胞较多的视野，每个视野计数100个细胞。免疫组化染色阳性反应为明显高于背景染色的黄-棕色颗粒，由高年资病理科医师以双盲法进行判断。以半定量积分方法记录survivin基因表达结果，根据免疫组化染色反应的深度及染色阳性细胞占观察的肿瘤细胞的百分比计分，两项指标分值的乘积分为4级：0～1分为阴性(-)，2～4分为弱阳性(+)，5～8分为阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)。

1.2.3 肿瘤细胞悬液制备及MTT药物敏感试验 取瘤体无坏死部位置于Hanks液无菌小瓶，PBS反复冲洗后剪成糊状，铜网过滤，1 000 r/min离心5 min，去上清，Hanks液漂洗，10%胎牛血清RPMI-1640培养液重悬，以0.4%台盼蓝染液计数，调整单细胞悬液至活细胞浓度3×105/ml。取单细胞悬液加入96孔培养板，每孔180 μl。用药组加入药物终浓度为10倍血浆峰值浓度的奥沙利铂，设3个复孔；对照组不加药物；空白组无培养细胞。置CO2培养箱中，37 ℃培养48 h，各孔加入5 mg/ml的噻唑蓝(MTT)10 μl，继续培养4 h。以酶标仪在570 nm波长处检测吸光度(A)值。取3孔A值的平均值作为最终A值。肿瘤细胞抑制率=(对照组A值-用药组平均A值)/(对照组A值-空白组A值)×100%。判定标准：肿瘤细胞抑制率<30%为耐药，30%～50%、>50%分别为中度敏感、高度敏感。

1.3 统计学方法

应用统计学软件SPSS 19.0分析和处理研究数据，其中survivin基因表达情况、原发性胃癌的病理特征、奥沙利铂的耐药性等计数资料采取率(%)表示，组间对比进行χ2检验，等级资料采用秩和检验，原发性胃癌survivin基因表达与奥沙利铂耐药性的关系采用Spearman相关性分析；以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 survivin基因表达情况

Survivin阳性着色位于细胞质(多见于胞质)。原发性胃癌标本中，survivin基因阳性表达率为68.75%，癌旁组织标本阳性表达率为11.11%，差异有统计学意义(χ2=33.003，P<0.05)，见表1。

表1 原发性胃癌、癌旁组织标本中survivin基因表达情况(例，%)

2.2 survivin基因表达与原发性胃癌病理特征的关系

Ⅲ～Ⅳ期、发生淋巴结转移的原发性胃癌患者癌组织survivin基因阳性表达率明显高于Ⅰ～Ⅱ期、未发生淋巴结转移的患者，比较有统计学意义(P<0.05)；不同性别、年龄、解剖位置的患者癌组织survivin基因表达情况比较无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 survivin基因表达与胃癌病理特征的关系(例，%)

2.3 原发性胃癌survivin基因表达与奥沙利铂耐药性的关系

本组80例原发性胃癌组织对奥沙利铂耐药者22例，达27.50%；随着survivin基因表达强度的增强，奥沙利铂耐药率逐渐增高，敏感性逐渐下降，差异经秩和检验有统计学意义(Z=12.051，P<0.05)；Spearman相关性分析显示原发性胃癌survivin基因表达与奥沙利铂耐药率呈正相关(γ=0.447，P<0.05)。见表3。

表3 原发性胃癌survivin基因表达与奥沙利铂耐药性的关系/例

3 讨论

作为凋亡抑制蛋白家族中1个结构独特的新成员，survivin具有抑制细胞凋亡，促进细胞增殖的作用。已有大量文献[6-8]证实survivin基因在多种恶性肿瘤细胞质中表达，如肺癌、卵巢癌、膀胱癌、结直肠癌等，具有肿瘤特异性表达的特点。有报道[9]发现survivin是G2/M期的调节基因，其表达水平与细胞周期密切相关，继而可参与细胞周期调控、有丝分裂及肿瘤的恶性转化。潘存伟等[10]的报道显示，survivin基因表达与肿瘤分化程度、胃癌局部浸润、淋巴结转移及TNM分期有关，并与微血管密度(MVD)具有明显的相关性，由此认为的过度表达是胃癌发生过程中的早期事件，并证实survivin基因能够促进胃癌血管形成。本研究结果显示，Survivin阳性着色位于细胞质，原发性胃癌标本中survivin基因阳性表达率明显高于癌旁组织中阳性表达率(68.75% vs 11.11%)；且Ⅲ～Ⅳ期、发生淋巴结转移的原发性胃癌患者癌组织survivin基因阳性表达率明显高于Ⅰ～Ⅱ期、未发生淋巴结转移者。以进一步表明胃癌组织中survivin基因表达水平高，且可反映其病理特征，与上述报道具有一致性。

更值得关注的是，本组80例原发性胃癌标本对奥沙利铂耐药者22例，达27.50%，随着survivin基因表达强度的增加，奥沙利铂耐药率逐渐增加，敏感性逐渐下降。Spearman相关性分析结果证实原发性胃癌survivin基因表达与奥沙利铂耐药率呈正相关，即胃癌组织中survivin基因表达与奥沙利铂耐药性密切相关。谢丽等[11]在关于胃癌药物敏感度的研究中发现Survivin mRNA表达用于判断奥沙利铂敏感度的准确率为70%，与本文观点类似。目前，肿瘤多药耐药的作用机制非常复杂，临床已明确的可能机制主要包括[12-13]：①细胞微环境发生改变；②膜转运蛋白介导的药物外排及改变细胞内药物浓度；③拓扑异构酶II等相关解毒酶的表达异常；④细胞凋亡途径与增殖分化异常。survivin基因为目前为止已知的抑制细胞凋亡能力最强的因子，我们认为，survivin基因影响奥沙利铂耐药性的原因与其抑制细胞凋亡能力密切相关，由于其能够抑制细胞凋亡的发生，继而可促进细胞的有丝分裂和加快新生血管生成，继而参与调节肿瘤细胞的耐药性。周露婷等[14]前期报道对survivin基因影响胃癌细胞耐药性有不同的解释，即survivin表达高的癌细胞对某些化疗药物不敏感，或者化疗本身诱发了survivin的表达，继而增加了肿瘤细胞的生存力。贾楠等[15]则与本文持类似一致，认为survivin属于肿瘤特异性凋亡抑制因子，可通过增强胃癌细胞的凋亡抵抗能力而导致胃癌细胞对铂类药物产生耐药。造成这种差异的原因可能为不同研究探讨的化疗药物不同或患者存在个体化差异，可见survivin基因对包括奥沙利铂在内的化疗药物耐药性的影响尚需进一步探讨。

综上，胃癌组织survivin基因表达与奥沙利铂耐药性相关，抑制survivin基因表达有可能逆转化疗抵抗，有望为提高胃癌化疗疗效提供新的方向。