搜风顺气丸对咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠γδT17的抑制作用

郭肖瑶 底婷婷 赵京霞 王 燕 解欣然 翟春艳 刘正荣，2 蒙玉娇，2 刘 宇，2 郭简宁，2 张 璐 王 宁 张 蕾 李 萍*

(1. 首都医科大学附属北京中医医院 北京市中医研究所 银屑病中医临床基础研究北京市重点实验室，北京 100010; 2. 北京中医药大学，北京 100029)

银屑病是一种炎性皮肤病。中医称为“白疕”[1]，《医宗金鉴》谓白疕“此证俗名蛇风，生于皮肤，形如疥疹，色白而痒，搔起白皮。由风邪客于肌肤，血燥不能荣养所致”，搜风顺气丸可养血润燥，祛风止痒。但目前对于其作用机制研究较少。本研究进一步观察药物作用环节，并揭示其可能的作用机制，作为临床应用的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

北京华阜康生物科技股份有限公司，8周龄，雄性，BALB/c小鼠40只，体质量18～20 g，实验动物许可证号：SYXK(京)2018-006。

1.2 试剂、药物及仪器

北京同仁堂制风顺气丸(Z11020031)，取一颗药丸溶于13.3 mL双蒸水中配成溶液备用。按照成人(60 kg)的剂量，根据人与动物间药物剂量换算比例换算成小鼠剂量(0.68 g/mL)每日灌胃。四川明欣药业有限责任公司制咪喹莫特乳膏，上海信谊药厂有限公司制甲氨蝶呤片; H2O2去氧离子水; Ki-67单克隆抗体(美国eBioscience公司，160031); CD3一抗工作液(美国Abcam公司); 进口山羊血清工作液(北京中杉金桥生物技术有限公司)、PCR试剂盒公司(天根生化科技有限公司)等。正置显微镜和图像采集系统(日本Olympus公司，BX51); 酶标仪(美国Thermo公司，Multiskan Spectrum); 垂直电泳仪(美国BIO-RAD公司，Mini-Protean3); 远红外激光成像系统(美国LI-COR公司)。

1.3 动物造模、分组、给药

动物造模参考Nadeem等[2]银屑病样小鼠模型制备方法。戊巴比妥钠(80 mg/kg)，腹腔注射麻醉，背部备皮 2 cm×3 cm，单笼饲养。对备皮后小鼠采用数字表法，随机分为空白对照组、模型组、搜风顺气组及甲氨蝶呤组，每组10只。空白组小鼠背部每日涂抹等量凡士林，其余小鼠背部每日涂抹5%(质量分数)咪喹莫特乳膏 62.5 mg。 同时灌胃给药，1次/d，每次 0.4 mL，连续6 d。

1.4 检测指标及方法

1.4.1 皮损病理学改变、表皮Ki-67表达及CD3+T淋巴细胞浸润

HE染色观察皮损改变。并在400倍镜下测量表皮厚度。免疫荧光染色观察Ki-67的表达并在400倍镜下，在阳性表达部位随机选5个视野，观察每例标本皮肤组织学改变并记录阳性细胞数量。对皮损CD3+T淋巴细胞浸润进行免疫组织化学法检测并计算数量。

1.4.2 小鼠脾脏、胸腺、双侧腹股沟淋巴结的质量

第7天电子天平称取脾、胸腺、双侧腹股沟淋巴结的重量，记录脾指数[脾质量/体质量(mg/g×10)]、胸腺指数[胸腺质量/体质量(mg/g×10)]、淋巴结指数[淋巴结质量/体质量(mg/g×10)]并记录数据。

1.4.3 流式细胞术分析小鼠双侧腹股沟淋巴结，胸腺细胞组成比例

常规制备组织单细胞悬液，每1×106细胞加入100 μL 抗-CD3和 抗-TCR-γ/δ荧光抗体标记γδT细胞，抗-CD3、抗-TCR-γ/δ和 抗-CD3和抗-TCR-RORγ荧光抗体标记 RORγt细胞，常温避光孵育30 min。使用流式细胞仪检测，FACSDiva分析。

1.4.4 皮损中STAT3相关通路蛋白磷酸化信号转导与转录激活因子3(phosphorylated-signal transduction and activators of transcription 3，p-STAT3)表达的检测

BCA试剂盒定量背部皮损提取的蛋白。加入p-STAT3及β-actin单克隆抗体进行蛋白质印记分析，计算灰度值。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 搜风顺气丸对咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠模型皮损的影响

1)肉眼观察: 空白对照组小鼠皮肤始终光滑、粉嫩，无任何改变。模型组于第 2～3 天开始出现皮损，背部红色斑点逐渐从点扩大到片状，鳞屑渐多、浸润加重，第7天银屑病样模型形成。 甲氨蝶呤、搜风顺气组皮损与模型组同期相比，小鼠鳞屑明显变薄、减少，鳞屑厚度减轻，红斑色浅面积小，皮肤增厚程度轻，浸润不明显，皮损症状均有所缓解(图1)。依据PASI评分可见与模型组相比, 甲氨蝶呤组及搜风顺气丸组的鳞屑、浸润、红斑及总体评分均有所降低，搜风顺气丸组在鳞屑、浸润方面作用更为显著(图2)。

图1 第7天各组小鼠皮损改变Fig.1 Gross observation of mice on day 7 of treatmentA: control group; B: model group; C: MTX group; D: SFSQ group; MTX: methotrexate; SFSQ: Soufengshunqi decoction.

图2 咪喹莫特诱导的各组小鼠1～7 d 皮损 PASI 评分趋势Fig.2 PASI scores of mouse skin lesions induced by imiquimod

2)表皮组织形态学:空白组表皮层较薄，模型组增厚数倍，角化不全，角化过度、严重炎性细胞浸润，大量基底细胞核分裂; 甲氨蝶呤、搜风顺气组表皮比模型组薄、角化不全细胞较少，浸润较轻，基底细胞核分裂不明显，搜风顺气组改善尤为明显(图3)。

图3 第7天表皮厚度测量及病理改变Fig.3 Histopathological observation of skin lesions on day 7 in each group

2.2 搜风顺气丸抑制咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠皮损部位Ki-67阳性表达

空白组表皮内 Ki-67 阳性细胞局限于基底层且数量较少。 模型组于基底层棘层均大量表达，差异有统计学意义(P<0.001)，搜风顺气组局限于基底层且减少明显(P<0.001)(图4)。

图4 免疫组织化学法染色监测各组小鼠皮损中 Ki-67 的表达Fig.4 Ki-67 expression in the skin lesions and the quantitative analysis of the Ki-67 staining positive cell numbers in the skin lesions of each group(IFC staining，400×)A: control group; B: model group; C: MTX group; D: SFSQ group; MTX: methotrexate; SFSQ: Soufengshunqi decoction.

2.3 搜风顺气丸抑制咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠皮损中CD3的表达

空白组皮损真皮 CD3+T细胞较少，模型组真皮层阳性细胞数明显增多，400倍显微镜视野下模型组CD3+T细胞数量明显高于空白组; 甲氨蝶呤组、搜风顺气组细胞数量均低于模型组(表1，图5)。

表1 各组7 d 后小鼠皮损中 Ki67、 CD3+ 的表达Tab.1 Comparison of the number of Ki-67，CD3+in high power microscopic after 7 days (positive cells number)

图5 免疫组织化学法染色监测各组小鼠皮损中 CD3+ 的表达Fig.5 CD3+ cells in the skin lesions and the quantitative analysis of CD3+ positive cell numbers in the skin lesions in each group (IHC staining，400×)

2.4 搜风顺气丸改善咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠免疫系统异常活化

第7天小鼠脾脏、胸腺、淋巴结指数，模型组脾指数高于空白组，两者差异有统计学意义(P<0.05,图6)，各用药组脾的质量均较模型组低(P<0.001)。模型组淋巴结指数高于空白组(P<0.001)，各用药组均较模型组低，其中搜风顺气组差异有统计学意义(P<0.01)。模型组胸腺指数高于空白组(P<0.01)。

图6 第7天小鼠体质量、脾及脾指数、胸腺指数及双侧腹股沟淋巴结指数Fig.6 Body weight，spleen and spleen index，thymus index and lymph node index on day 7 of each group of mice n=10,*P<0.05，**P<0.01， ***P<0.001 vs model; MTX: methotrexate；SFSQ: Soufengshunqi decoction.

2.5 搜风顺气丸对咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠淋巴结及胸腺CD3+T细胞的影响作用

各组小鼠双侧腹股沟淋巴结CD3+T细胞中CD4+T比例差异无统计学意义。 淋巴结γδTCR+比例可见模型组高于空白组且搜风顺气组小鼠γδT+比例低于模型组。γδ T+ RORγ T+在小鼠淋巴结 CD3+ T细胞中模型组表达明显高于空白组(P<0.01)，并在搜风顺气组中降低。 而γδT+RORγt-在各组中均差异无统计学意义(图7)。

图7 各组小鼠双侧腹股沟淋巴结及胸腺 CD3+T细胞中 CD4+T、γδTCR+、γδT+RORγt+、γδT+RORγt-比例分析Fig.7 Analysis of CD4+T，γδTCR+，γδT+ RORγt+，γδT+RORγ T-proportion in lymph nodes and thymus CD3+T cells of each group

各组小鼠胸腺CD3+T细胞中CD4+T细胞比例，差异无统计学意义(P>0.05)。胸腺γδ T+比例可见模型组高于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)，且搜风顺气组小鼠γδ T+比例低于模型组。 γδT+RORγt+在模型组表达高于空白组，并在搜风顺气组中降低。 而γδT+RORγt-在模型组高于空白组且搜风顺气组小鼠比例低于模型组 (P<0.01)。

2.6 搜风顺气丸抑制咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠皮损中p-STAT3的表达

模型组p-STAT3的表达量高于空白组，相对于模型组，搜风顺气组在p-STAT3的表达较少(P<0.05,图8)。

图8 第 7 天小鼠皮损中 p-STAT3蛋白的表达Fig.8 Expression of p-STAT3 in skin lesionsat day 7 of treatment

3 讨论

银屑病中医称为“白疕”[3]。《医宗金鉴》[4]记载“此证俗名蛇风，生于皮肤，形如疥疹，色白而痒，搔起白皮。由风邪客于肌肤，血燥不能荣养所致”。风邪常兼加他邪，致湿毒、风热、风寒等。另外，肠胃无物不受，导致虚形于外热毒积于中。可见银屑病以风邪血燥为先，而后内蕴热毒。因此当祛风养血润燥，加以迫腑泻热。《医宗金鉴》[4]便首次记载:“治疗白疕先以防风通圣丸，次服搜风顺气丸”。方中补养肝肾精血的牛膝、山萸肉、菟丝子、山药等借枳壳、槟榔之行气作用，达到滋润肌肤的目的。气行则血行，血行风自灭，故使用枳壳、槟榔行血，顺气破滞宽肠以助火麻仁、郁李仁、大黄滑利润燥而通幽，而肺与主津液的大肠相表里，由此可借肺气宣发以充养肌肤。 防风可祛除在上之风，独活祛除在下之湿，车前子引山药、牛膝、萸肉、菟丝子入肝肾之经[5]。

目前广泛应用的银屑病研究模型为咪喹莫特诱导的小鼠模型，可快速诱导出与人类银屑病相似的皮肤表现。观察皮损改变可见SFSQ组鳞屑薄且少，皮损表现较光滑、柔软，红斑色浅、面积小，浸润程度更轻。小鼠鳞屑、浸润和红斑的积分降低，在降低疾病发展速度、减轻皮损加重程度上，搜风顺气丸均有明显作用。 作为核抗原的 Ki67可反映细胞增生情况[6-7]，搜风顺气丸可以抑制表皮棘细胞层的异常增生，而不影响基底层细胞的正常增生。同时减少真皮质 CD3+ T淋巴细胞浸润，抑制T细胞增生。减轻脾脏及淋巴结的重量，改善免疫系统的异常活化。

搜风顺气丸还可同时降低腹股沟淋巴结中及胸腺中γδT+RORγt+细胞比例从而抑制 IL-17的产生。作为胞质蛋白家族[8]，STATs参与细胞信号转运[9]。 STAT3通路可调控产生IL-17的细胞分化与分泌[10-11]。 银屑病患者皮损中 STAT3 处于高表达状态[12-13]。搜风顺气丸可减少 p-STAT3蛋白的表达含量，抑制 STAT3通路的异常活化，降低 IL-17类细胞因子的分泌，从而抑制银屑病炎性反应状态。

本次研究中通过银屑病样小鼠模型的建立，观察到皮损部位的减轻改变，减少γδT细胞，尤其是γδT17在胸腺组织中的浸润比例，同时还可以抑制 STAT3通路的磷酸化，降低 IL-17类细胞因子的分泌以减轻免疫反应。作为临床治疗银屑病常用的免疫抑制剂，甲氨蝶呤可改善患者症状，但具有长期服用安全性较差、易引起不良反应导致病情恶化的缺点。针对银屑病病因未完全明确、无特效药物的现状，复方中药因临床疗效确切且不良反应少成为研究热点，具体作用机制亟待深入探索。以上研究为中医药临床治疗提供了基础理论依据，并为方剂的优化提供方向。