重组人凝血因子Ⅷ药物的结构改造及其类似物开发的研究进展

侯闪，尹骏，姚文兵，高向东*

（1.中国药科大学生命科学与技术学院，江苏 南京 210009；2.中国药科大学江苏省生物药物成药性研究重点实验室，江苏 南京210009）

血友病A是一种由凝血因子Ⅷ（Factor Ⅷ，FⅧ）基因缺陷（功能丧失、突变、缺失或基因倒位）引起的罕见的X连锁的遗传性出血性疾病，其特点是缺乏参与血液凝固的蛋白质FⅧ，其发病人数约占血友病患者总数的80% ～ 85%，每10 000名男性新生儿中就有1 ～ 2名血友病患者；根据临床严重程度和基因突变类型，血友病A可分为重度、中度和轻度，FⅧ因子活性水平分别为不足正常水平的1%、1% ～ 5% 和 6% ～ 40%[1]。缺乏 FⅧ会使关节和软组织自发性出血，进而导致血友病性关节病。血友病A患者也可能会因创伤或手术过程中凝血功能障碍造成失血过多，严重者可危及生命。

FⅧ蛋白替代疗法是临床治疗血友病A的主要方法[1-2]。最初用于治疗血友病A的FⅧ产品来源于血浆冷沉淀，虽然利用其进行间歇性治疗能够有效控制出血，但并不能改善因长期出血造成的关节损伤。在发达国家，一种更为理想的治疗方法——预防治疗逐渐成为血友病治疗的标准。在预防性治疗过程中，长期静脉注射FⅧ以维持FⅧ水平在1%以上，在一定时间内可以使凝血功能恢复正常，从而达到防止出血的目的，这种策略通常用于重度或中度血友病A患者。20世纪90年代，重组FⅧ（如Kogenate®、Recombinate®）的开发克服了血浆来源FⅧ的一些缺点，包括潜在的病毒污染、血液制品来源有限及成本高等，但仍存在着蛋白稳定性差、产量低以及受到静脉注射给药方式的限制等问题。另外，抑制物的形成和FⅧ半衰期短是血友病A替代治疗中的两大关键问题[3]。为了解决以上问题，近年来人们利用蛋白质工程技术对重组FⅧ进行结构改造以获得改构重组的FⅧ药物，进一步改善了FⅧ蛋白的活性、稳定性及半衰期。同时基于FⅧ的作用机制，FⅧ抗体模拟类似物也不断被开发出来。因此，本文对已上市或正在研究中的重组人FⅧ改构药物及其类似物开发的研究进展进行综述。

1 FⅧ的结构及其作用机制

FⅧ基因定位于X染色体长臂末端（Xq28），全长186 kb，包含25个内含子和26个外显子，其编码由2 332个氨基酸组成的成熟蛋白。FⅧ蛋白的结构域为A1-A2-B-A3-C1-C2（见图1），这些结构域在FⅧ蛋白的功能中发挥着关键作用，每个结构域都有针对凝血级联反应中不同组分的特定结合位点。在细胞内加工过程中，全长的人FⅧ（hFⅧ）蛋白在多个位点发生蛋白水解，其中最主要的切割位点是B结构域羧基末端的成对碱性氨基酸蛋白酶Furin的识别基序（R-X-R）。在Furin的作用下，FⅧ蛋白可产生2条多肽链，即重链（A1-α1-A2-α2-B）和轻链（α3-A3-C1-C2），α1、α2 和 α3 由 30 ～ 40个氨基酸组成，富含酸性残基。2条链可以通过金属依赖性的非共价结合作用形成异源二聚体，这是hFⅧ蛋白的主要分泌形式[4-5]。被分泌之后，血管内皮细胞产生的大的、多聚体的血管性血友病因子（von Willebrand Factor，vWF）可作为载体蛋白与FⅧ蛋白的A3结构域N末端区域和C2结构域结合形成FⅧ/vWF复合物，FⅧ蛋白在Arg372、Arg740和Arg1689处可被凝血酶（Ⅱa）切割，产生有活性的FⅧ（activated FⅧ，FⅧa），并与vWF分离[5]。FⅧa是活化的FⅨ（activated FⅨ，FⅨa）的辅助因子，在Ca2+和血小板Ⅲ因子（PF3）共同存在条件下，FⅨa和FⅧa形成FⅧ复合物，可以在内源性凝血途径中激活FⅩ产生活化的FⅩ（activated FⅩ，FⅩa），FⅩa可在Ca2+和PF3共同存在的条件下，与FⅤ结合形成凝血酶原激活物，进一步激活凝血酶参与后续的凝血途径以达到凝血目的。

图 1 天然FⅧ的蛋白结构示意图Figure 1 Schematic diagram of the protein structure of natural FⅧ

2 基于结构改造的重组FⅧ药物的开发

目前，对FⅧ的结构改造主要包括删除次要结构域（常规FⅧ）和长效化修饰（长效FⅧ），以下对这2个方面分别介绍。

2.1 常规FⅧ药物的开发

20世纪90年代初，Bayer和Baxter两大公司开发了最初的全长FⅧ产品Kogenate®和Recombinate®，两者由于制造工艺的发展已演变成今天的Kovaltry®和Advate®。这些重组FⅧ产品与血浆来源的FⅧ类似，其中心B结构域有不同程度的截短，因此这些产品主要是由相对分子质量为170 000 ～ 280 000的蛋白异构体组成的混合物。20世纪90年代后期，人们意识到FⅧ中的B结构域（741 ～1 648）对其凝血催化活性并不是必需的[6]。与全长重组FⅧ相比，B结构域缺失的重组FⅧ（B-domain deleted recombinant factor Ⅷ，BDD-FⅧ）具有更好的稳定性和更高的分泌表达效率，而其活性并未受到影响。因此，在过去的十几年中，多种重组BDD-FⅧ药物已被开发并应用于临床（见图2）。

2008年上市的Xyntha®（Moroctocog alfa）是由Wyeth公司继首个B结构域（744 ～ 1 637）缺失的重组FⅧ产品（ReFacto®）开发的后续产品，又名ReFacto®AF，其保留了B结构域中的14个氨基酸肽段。与ReFacto®相比，Xyntha®通过无白蛋白细胞培养工艺生产，在亲和层析中使用合成肽亲和配体（TN8.2）取代了小鼠单克隆抗体，并在纯化过程中增加了35 nm病毒过滤步骤，使药物安全性更高，而药动学参数与前者并无差异[7]。

韩国Green Cross公司开发的Greengene F®（beroctocog alfa）是一种高度同源的B结构域（741～1 648）完全缺失的重组FⅧ产品，其分别以重链（A1-A2）和轻链（A3-C1-C2）的形式进行表达纯化而得到的均一产物，该产品于2008年在韩国上市。在生产工艺开发中，Greengene F®通过添加有机溶剂/洗涤剂（S/D）灭活病毒、采用20 nm孔径滤膜去除病毒以及使用无白蛋白制剂配方等措施，最大限度地降低了病毒污染的风险，提高了药物安全性[8]。

Novo Nordisk公司于2013年上市的NovoEight®（turoctocog alfa）是一类B区截短（751 ～ 1 637）的重组FⅧ产品，其保留了包括编码天然B结构域N 末端（741 ～ 750）和 C 末端（1 638 ～ 1 648）在内的21个氨基酸，同时保留了B区O-糖基化位点，可用于糖基化修饰。在NovoEight®中，1 680位酪氨酸被完全硫酸化，使FⅧ与vWF的结合亲和力高于之前的重组FⅧ产品，从而最大限度地减少了未结合的FⅧ的循环和FⅧ的清除[9]。NovoEight®已被证明具有与全长重组FⅧ产品（Advate®）相似的药动学特性[10]。在世界血友病联盟（WFH）2018年世界大会上，Novo Nordisk公布了一项有关NovoEight®长期稳定性实验的结果，在高储存温度和湿度条件下，NovoEight®仍然能够保持其效价强度，这一发现在一定程度上解决了该药物制剂的储存问题。

2015年上市的首个利用人细胞系HEK293F（human embryonic kidney，人胚肾细胞）生产的Nuwiq®（simoctocog alfa）是由 Octapharma公司开发的一类B区截短（749 ～ 1 648）型重组FⅧ产品，其保留了天然B结构域N端8个氨基酸，并添加了额外的8个氨基酸短肽（QAYRYRRG）。与之前在中国仓鼠卵巢（Chinese hamsters ovary，CHO）细胞系或乳仓鼠肾（baby hamster syrian kidney，BHK）细胞系中生产的重组FⅧ不同，利用人细胞系表达获得的重组FⅧ的主要优势是获得了类似人类的翻译后修饰（post-translational modification，PTMs）模式，使其类似于内源性FⅧ分子，不携带非人源的抗原表位，因此在降低药物免疫原性和减少抑制物的形成方面具有一定优势[11-12]。

目前，Afstyla®是由CSL Behring公司开发并于2016年上市的首个获批治疗血友病A的重组单链FⅧ，其是利用B结构域保留的24个氨基酸短肽（741～764）使重链和轻链（去除1 649 ～ 1 652）共价键连接形成的单链结构。研究证实，Afstyla®与全长重组FⅧ生物活性相当，但稳定性更高，且与vWF具有高亲和力；此外，vWF还可能限制抗原提呈细胞对重组FⅧ的识别作用，具有潜在的降低药物免疫原性的作用[13-15]。

2.2 长效FⅧ药物的开发

由于血浆来源或常规重组FⅧ存在生物活性不稳定、半衰期短等问题，需要长期频繁静脉注射FⅧ，不仅给患者带来痛苦，还可能产生抗体。因此，长效FⅧ药物的开发至关重要（见图3）。

图 3 长效FⅧ药物的蛋白结构示意图Figure 3 Schematic diagram of the protein structure of FⅧ with extended half-life

2.2.1 聚乙二醇修饰 聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）是一类高分子聚合物，具有较大的流体力学半径，将PEG共价修饰在功能蛋白质分子上，可通过保护蛋白质分子免受血液中的蛋白酶水解或降低清除率来达到延长半衰期的作用，对于FⅧ来说，PEG可阻断FⅧ与低密度脂蛋白受体相关蛋白（LRP）家族受体的相互作用，进而降低其肝脏清除率[16]。

2015年 上 市 的 Adynovate®（BAX855） 是 由Baxalta公司基于Advate®开发的首个PEG修饰的全长重组FⅧ分子。利用氨基随机进行PEG（相对分子质量为20 000）修饰，使得全长FⅧ中平均有2个赖氨酸侧链可被其修饰，这种方法使PEG修饰在分子的不同的位点上，从而得到PEG修饰的重组FⅧ混合物。动物实验表明，与Advate®相比，Adynovate®的半衰期延长，相关疗效也随之延长[16]。临床研究发现，Adynovate®对于治疗严重血友病A患者的出血发作和预防是安全有效的，受试者未发生超敏反应，对过往接受过治疗的患者使用Adynovate®治疗后未见抗FⅧ抑制性抗体风险的增加，与标准重组FⅧ（半衰期为10.5 h）相比，Adynovate®在人体中的半衰期延长了1.4倍（14.3 h）[17-18]。

Bayer公 司 于 2018年 上 市 的 Jivi®（BAY 94-9027）是一类基于B结构域（744 ～ 1 637）缺失的定点PEG修饰的重组FⅧ分子。其通过定点突变的方法，在A3结构域中引入由赖氨酸到半胱氨酸的突变，从而使相对分子质量为60 000的PEG-马来酰亚胺与引入的半胱氨酸发生特异性结合，进而实现PEG的定点修饰。动物实验结果表明，BAY 94-9027保持了凝血活性，与未修饰FⅧ相比较有较低的免疫原性，同时还改善了家兔和血友病小鼠的药动学性质[19]。临床研究结果显示，BAY 94-9027具有良好的预防出血作用，并且能够有效控制并治疗手术中或其他条件下的出血事件，其在人体中的半衰期为18.4 h，相比于标准重组FⅧ（12.9 h）提高了 1.4 倍[19-21]。

Esperoct®（N8-GP）是由 Novo Nordisk公司开发的一类利用定点糖基化来延长分子半衰期，同时保持凝血功能不变的重组FⅧ分子，已于2019年获批上市。N8-GP是在Turoctocog alfa的基础上进行进一步改造得到的，Turoctocog alfa保留了B结构域中的21个氨基酸短肽，其中包含了O-糖基化位点，O-糖链结构末端的唾液酸可以被一个相对分子质量为40 000的含支链PEG中的共轭唾液酸取代，进而得到定点修饰的PEG产物。临床研究中，Esperoct®显示出良好的耐受性、预防作用和安全性[22-23]。与标准重组FⅧ（半衰期为11.7 h）相比，Esperoct®在青少年或成人患者体内的半衰期延长了1.6倍（19 h），在儿童患者体内的半衰期延长了1.9倍[24-25]。

2.2.2 Fc融合 Eloctate®是由Biogen Idec公司开发并于2014年上市的一类由单分子的B结构域（744～1 637）缺失的FⅧ（BDD-FⅧ）与二聚体人Fc区融合而成的重组FⅧ分子。Fc融合通过利用新生儿Fc受体和内源性IgG循环途径延长重组FⅧ的半衰期，延缓IgG和Fc融合蛋白的溶酶体降解，并使其进入循环中。在严重血友病A的小鼠和狗模型中，单体Fc融合蛋白可将FⅧ的半衰期延长约2倍[26]。临床研究表明，Eloctate®的终末半衰期（19.0 h）比标准重组FⅧ（12.4 h）延长1.5倍，在严重血友病A青少年和成年患者中，能有效预防和治疗出血事件，且具有良好的耐受性[27-28]。此外，Fc融合并不损害FⅧ活性或导致免疫原性增加。因此，与传统FⅧ治疗方案相比，Eloctate®具有将注射频率降低50%的潜力，这一治疗负担的改善可能会提高血友病A患者的预防依从性。

2.2.3 其他类长效FⅧ药物 在血浆中，95%以上的FⅧ与vWF以非共价复合物的形式进入循环，在维持止血方面具有重要作用，此外，vWF与FⅧ的相互作用在FⅧ的功能、免疫原性及清除等方面起着至关重要的作用。vWF是相对分子质量为250 000的蛋白质，可形成大的多聚体（相对分子质量高达2.0×107），其半衰期约为16 h。研究表明，vWF在一定程度上可以稳定并保护FⅧ免受自身清除途径的影响，但其也使FⅧ进入vWF介导的清除途径[29]，与vWF的相互作用限制了当前技术（Fc融合、PEG修饰）实现的FⅧ半衰期延长的程度。因此，稳定FⅧ与vWF的相互作用并克服FⅧ依赖vWF的降解途径的限制也是FⅧ实现长效化的另一策略。

Bioverativ公司开发的BIVV001是一类新型在研的可以突破vWF限制上限的长效重组FⅧ分子[30]，该分子由vWF的FⅧ结合区域D'D3区域（结合FⅧ C1和C2结构域的必需区域）通过Fc共价结合在FⅧ上，这一修饰增加了D'D3的局部浓度，使其能够竞争内源性vWF，同时避免了vWF清除的限制。除D'D3结构域外，该分子中还含有2个XTEN连接子：一个XTEN连接子取代FⅧ的B结构域，另一个连接到D'D3结构域，XTEN是一种由6个氨基酸重复序列（Gly、Ala、Pro、Glu、Ser、Thr）组成的非结构多肽，在一定程度上具有延长融合蛋白半衰期的作用。D'D3结构域和XTEN连接子在凝血级联反应中凝血酶激活的条件下可被切掉并移除，不影响FⅧ的活性。Ⅰ/Ⅱa期临床试验结果显示，单次低剂量（25 IU·kg-1）的BIVV001可将FⅧ的半衰期延长至37 h，与标准重组FⅧ（半衰期为13 h）相比，其半衰期延长了2.8倍，在静脉注射后第5、7 d的平均残留FⅧ活性分别是13%和5.6%，未产生抑制物，并具有良好的耐受性[30]。

FⅧ-KB013bv是由 Muczynski等[31-32]研究的一类B结构域由2个识别vWF D'D3结构域的非抑制性纳米抗体取代的FⅧ-纳米抗体融合蛋白，该蛋白中的纳米抗体部分可以靶向vWF。FⅧ-KB013bv具有FⅧ完全活性，其对vWF的亲和力是标准重组FⅧ药物的25倍。小鼠体内实验结果显示，该分子能够延长FⅧ的半衰期[31]。与BDD-FⅧ相比，FⅧ-KB013bv的免疫原性显著降低，其可能的原因是FⅧ-KB013bv对vWF的高亲和力使该复合物在与细胞抗原呈递细胞相互作用时不会发生解离，这一过程降低了可用于呈递给T细胞的FⅧ的数量和FⅧ的摄取，从而减少了抗FⅧ抗体的形成[30]。此外，另一种正在进行的研究是利用白蛋白与D'D3融合形成融合蛋白，在过量的情况下与重组FⅧ共同静脉注射，原则上，这种融合蛋白能够竞争内源性vWF结合FⅧ，进而稳定并延长FⅧ半衰期[33]，但此方法仍需要进一步的数据来确定能否达到预期目标。

3 FⅧ类似物的开发

另一种治疗血友病A的新方法是寻找一种抗体作为FⅨa和FⅩ之间的桥梁，从而发挥FⅧa的辅因子功能[34-35]。与传统FⅧ药物相比，抗体的半衰期更长，且可以皮下给药，这种抗体不会与抗FⅧ抗体发生交叉反应，因此其可以为不能成功接受免疫耐受诱导（immune tolerance induction，ITI）的血友病A患者提供预防性治疗[3,36]。但这种方法的缺陷在于，FⅧ在体内发挥功能时需要特定的蛋白质-蛋白质和蛋白质-磷脂相互作用，并接受正负调控调节，而抗体可能不能模拟这些相互作用[37]。

目前，最先进的FⅧa模拟抗体是由Chugai公司开发的 Hemlibra®（emicizumab/ACE910）。Emicizumab是一种人源化的抗FⅨa/FⅩ不对称双特异性抗体（人IgG4/κ），其一只手臂识别FⅨa的表皮生长因子（EGF）样结构域1，另一只手臂识别FⅩ的EGF样结构域2，因此可以通过同时结合FⅨa和FⅩ而起到FⅧa辅因子模拟物的作用[37]（见图4）。但实际上，emicizumab不仅可以结合FⅨa和FⅩ，还可以结合FⅨ和FⅨa，因此它其实是一种四特异性抗体[38]，其与酶原FⅨ的结合可以隔离来自FⅨa的抗体，且与FⅩa的结合可以延迟凝血酶原（FⅩa-FⅤa与凝血酶原）复合物的组装。这些可能解释为什么在emicizumab临床试验中的患者需要使用他们之前使用的FⅧ产品治疗急性出血[39]。Emicizumab模拟FⅧa发挥凝血活性由FⅨa浓度驱动并且依赖于磷脂[37]，虽然其不能像FⅧa那样直接与磷脂结合（FⅧa将磷脂与FⅨ和FⅩ结合，促进它们之间的相互作用），但emicizumab可以以较弱的亲和力同时与FⅨ和FⅩ结合，使该分子某些部分间接结合磷脂。而emicizumab的调节方式与FⅧ并不类似，FⅧ仅在凝血酶切割后活化，然后通过A2结构域解离和活化蛋白C（activated protein C，APC）切割后失活，emicizumab则能够不断地将FⅨ-FⅨa连接到FⅩ-FⅩa发挥作用且不会失活，因此，emicizumab必须依赖凝血级联反应中的其他步骤来控制其促血栓形成的功能。临床研究结果证实，emicizumab对于血友病A成年和儿童患者包括体内已产生或未产生FⅧ抑制物的患者常规预防作用均有效[30,40]。因与FⅧ没有结构上的同源性，所以emicizumab不会诱导产生FⅧ抑制物或被已有的FⅧ抑制物所抑制。此外，emicizumab还具有皮下给药方式和较长的半衰期（约30 d）等额外优点[39]。药动学模型显示，在给予每周负荷剂量后，受试者可以通过每周（QW）、2周（Q2W）或每月（Q4W）剂量维持稳定的血浆水平，这足以维持临床研究项目中大多数受试者的无出血状态[41]。这种新疗法的总体疗效和安全性以及对实际应用的指导仍在不断发展中，需要进一步的数据来支持。

FⅧ双特异性抗体模拟方法的其他类似物正在进行临床前研究。如BS027125[42]，该抗体的双臂是通过酵母展示系统利用阳性和阴性选择产生的，能够特异性结合FⅨa和FⅩ而不是FⅨ和FⅩa，因此BS027125可以更好地模拟FⅧa选择性地将FⅨa桥连至FⅩ。尽管该抗体可特异性结合FⅩ而非FⅩa，并且对FⅨa具有更高的亲和力，但它仍然可保持与FⅨ的实质性结合，因此该抗体实质上是一种三特异性抗体。目前BS027125正处于临床前研究阶段。

图 4 FⅧ和Emicizumab作用机制示意图Figure 4 Schematic diagram of the action mechanisms of FⅧ and emicizumab

4 结语与展望

在过去的几十年中，血友病A治疗方法的不断发展使患者预期寿命显著延长。尽管存在着基因疗法和ITI等其他治疗方法，FⅧ替代疗法在血友病A的临床治疗中仍占据着至关重要的地位，但FⅧ分子稳定性差、半衰期短且长期使用后可产生抑制物仍然是替代疗法面临的关键问题。近十几年来，多种重组FⅧ药物及抗体模拟类似物已经获批上市或正处于临床研究阶段（见表1）。

表 1 上市或在研的FⅧ改构药物及其类似物Table 1 Structural modification of FⅧ and its antibody mimetics on the market or under investigation

常规FⅧ药物主要通过对B结构域的截短或删除、生产工艺优化或表达系统优化等改善FⅧ蛋白的稳定性或免疫原性，但并未达到延长半衰期的目的。传统的长效FⅧ药物是利用PEG或Fc等分子对FⅧ进行修饰，但其半衰期仅能延长1.4 ～ 1.6倍。由于FⅧ在血液循环中是以FⅧ/vWF复合物的形式存在，其半衰期不仅取决于自身的结构性质，还与vWF的结构性质和半衰期有关，因此进一步稳定FⅧ/vWF复合物的形成或延长vWF的半衰期可进一步改善FⅧ的半衰期，这可能是今后长效FⅧ药物开发的重点研究方向。近几年新开发的FⅧ抗体模拟类似物是一种以双特异性抗体形式模拟FⅧ功能的一种特殊抗体，其可适用于已有或未有抑制物的血友病A患者，并且具有皮下给药方式和更长的半衰期等优点，克服了FⅧ替代疗法中抑制物产生、半衰期短和受到静脉给药方式限制等缺点，进一步扩大了FⅧ替代疗法的应用范围。但是在体内FⅧ功能的发挥受到正负调控以及与其他分子之间复杂的相互作用的影响，而FⅧ的复杂相互作用及特异性是否能被双特异性抗体更好地再现，并产生更大的功效和更准确地反映FⅧ活性的多功能性，这可能是未来FⅧ类似物开发中需要解决的关键问题。

业界仍需要寻找更多的FⅧ改构产物和模拟类似物，以期望得到更多活性高、特异性强、免疫原性低、给药方式简便、半衰期长的FⅧ药物。