宫颈鳞状细胞癌中SIX1、SIX2、MMP11的表达及临床意义

贺敏，陈勇伟

十堰市太和医院1妇科，2泌尿外科，湖北 十堰 442000

宫颈鳞状细胞癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发生、发展具有相对鲜明的阶段性特征，即从低级别宫颈上皮内瘤变发展至高级别宫颈上皮内瘤变，甚至癌变发展为浸润癌[1]。肿瘤细胞具有明显的增殖和转移能力[2]。基质金属蛋白酶11（matrix metalloproteinase 11，MMP11）是基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）家族中的重要成员，对细胞外基质成分的降解作用较强，并能够促进肿瘤细胞的迁移[3]。同源异型蛋白SIX1和同源异型蛋白SIX2属于转录调控因子，可以调控下游多种基因的表达，尤其是与肿瘤细胞增殖和迁移有关的基因。本研究探讨了宫颈鳞状细胞癌中SIX1、SIX2和MMP11表达情况的相关性及临床意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年9月至2014年8月十堰市太和医院收治的行宫颈鳞状细胞癌根治术的宫颈鳞状细胞癌患者。纳入标准：①行全子宫、双附件及区域淋巴结清扫术，术后均辅以放疗、化疗（2～4个疗程），治疗方法无明显差别；②均经病理学检查确诊；③符合世界卫生组织（WHO）关于宫颈鳞状细胞癌的诊断标准[4]；④临床资料完整；⑤术后石蜡标本均于病理科保存完整。排除标准：①合并其他部位恶性肿瘤；②病理形态中合并腺癌、肉瘤成分；③术前接受过放疗、化疗等抗肿瘤治疗。根据纳入、排除标准，本研究共纳入125例宫颈鳞状细胞癌患者，患者年龄为35～78岁，平均年龄为（54.2±9.4）岁。另选取39例宫颈高级别上皮内瘤变患者，年龄为32～68岁，平均年龄为（50.1±10.2）岁；选取39例宫颈低级别上皮内瘤变患者，年龄为30～59岁，平均年龄为（42.1±10.7）岁；选取39例慢性宫颈炎患者，年龄为30～65岁，平均年龄为（40.3±9.8）岁。全部患者的年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。收集经病理确诊的宫颈病变患者的术后石蜡包埋组织标本。

1.2 检测方法

全部患者的术后组织标本均应用中性福尔马林缓冲液固定，切取厚度为2 mm的组织置于包埋盒内，常规脱水，石蜡包埋，切片后置于胶片上。SIX1、SIX2和MMP11均为浓缩液，先行预实验，选择最佳显色的浓度用于正式实验（最佳显色浓度：SIX1 为1∶100，SIX2 为1∶200，MMP11 为1∶300）。正式实验均采用免疫组化二步法进行检测，二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色，实验操作严格做好质量控制工作，减少人为误差。

1.3 结果判定

对SIX1、SIX2和MMP11染色结果的判断标准由病理科医师参照相关文献[5-6]进行适当修改。SIX1、SIX2和MMP11定位于细胞质和部分细胞膜，阳性细胞为浅黄色、黄色和棕黄色。根据染色强度和阳性细胞所占百分比进行评分。染色强度：无色为0分，浅黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。阳性细胞所占百分比：在400倍视野下计算染色细胞占视野细胞总数的百分比，共计数5个视野，取平均值，其中，＜5%为0分，5%～10%为1分，11%～30%为2分，31%～50%为3分，＞50%为4分。两项得分相加为最终评分，最终评分≤2分为阴性，＞2分为阳性。计算不同组织中SIX1、SIX2和MMP11的阳性表达率。

1.4 统计学方法

采用SAS 6.12软件对数据进行统计分析，计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验。采用Pearson法进行相关性分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同宫颈病变患者宫颈病变组织中SIX1、SIX2和MMP11阳性表达情况的比较

宫颈鳞状细胞癌组织、宫颈高级别上皮内瘤变组织、宫颈低级别上皮内瘤变组织、慢性宫颈炎组织中SIX1、SIX2和MMP1的阳性表达率比较，差异均有 统 计 学 意 义（χ2=31.418、41.150、21.826，P＜0.01）。宫颈鳞状细胞癌组织中SIX1、SIX2和MMP1的阳性表达率均明显高于宫颈高级别上皮内瘤变组织、宫颈低级别上皮内瘤变组织和慢性宫颈炎组织，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表1）

表1 不同宫颈病变组织中SIX1、SIX2和MMP11阳性表达情况的比较[n（%）]

2.2 不同临床特征宫颈鳞状细胞癌患者宫颈鳞状细胞癌组织中SIX1、SIX2和MMP11阳性表达情况的比较

肿瘤最大径≥2 cm、有淋巴结转移、增殖指数≥25%的宫颈鳞状细胞癌患者宫颈鳞状细胞癌组织中SIX1的阳性表达率均高于肿瘤最大径＜2 cm、无淋巴结转移、增殖指数＜25%的宫颈鳞状细胞癌患者，差异均有统计学意义（χ2=17.487、20.028、6.074，P＜0.05）；不同脉管瘤栓情况宫颈鳞状细胞癌患者宫颈鳞状细胞癌组织中SIX1的阳性表达率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。肿瘤最大径≥2 cm、有淋巴结转移、增殖指数≥25%的宫颈鳞状细胞癌患者宫颈鳞状细胞癌组织中SIX2的阳性表达率均明显高于肿瘤最大径＜2 cm、无淋巴结转移、增殖指数＜25%的宫颈鳞状细胞癌患者，差异均有统计学意义（χ2=8.893、15.012、12.561，P＜0.01）；不同脉管瘤栓情况宫颈鳞状细胞癌患者宫颈鳞状细胞癌组织中SIX2的阳性表达率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。肿瘤最大径≥2 cm、有淋巴结转移、有脉管瘤栓的宫颈鳞状细胞癌患者宫颈鳞状细胞癌组织中MMP11的阳性表达率均明显高于肿瘤最大径＜2 cm、无淋巴结转移、无脉管瘤栓的宫颈鳞状细胞癌患者，差异均有统计学意义（χ2=14.468、32.200、15.873，P＜0.01）；不同增殖指数宫颈鳞状细胞癌患者宫颈鳞状细胞癌组织中MMP11的阳性表达率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（表2）

表2 不同临床特征宫颈鳞状细胞癌患者宫颈鳞状细胞癌组织中SIX1、SIX2和MMP11的阳性表达情况（n=125）

2.3 宫颈鳞状细胞癌组织中SIX1、SIX2和MMP11表达的相关性

Pearson相关性分析结果显示，宫颈鳞状细胞癌组织中SIX1与MMP11的表达呈正相关（r=0.55，P=0.029），SIX2与 MMP11的表达呈正相关（r=0.49，P=0.042），SIX1与SIX2的表达未见明显相关性（P＞0.05）。

3 讨论

宫颈鳞状细胞癌发生于宫颈表面的鳞状上皮，其发生、发展与人乳头瘤病毒感染有关，人乳头瘤病毒感染会导致细胞发生癌变，从而形成挖空细胞。病情进展时，宫颈鳞状上皮发生异型增生。多种肿瘤相关基因在宫颈鳞状细胞癌组织中的表达异常。对于浸润性宫颈鳞状细胞癌，常表现出非角化性鳞状细胞癌的特征。宫颈鳞状细胞癌患者的预后较差，生存时间较短，但是，不同宫颈鳞状细胞癌患者的生存时间并不完全一致。临床评估宫颈鳞状细胞癌患者预后的辅助指标包括淋巴结转移、TNM分期、周围组织的侵犯情况等，这些指标不能从根本上判断患者的预后，而分子生物学的发展为宫颈鳞状细胞癌患者预后的判断提供了可能。有研究显示，在肿瘤进展的过程中，肿瘤细胞可分泌MMP，目前发现MMP家族共包括28个成员，在大部分恶性肿瘤中均有表达，其功能各不相同[7]。MMP11是MMP家族的重要成员，可以有效分解纤溶酶原及胶原，从而促进肿瘤的迁移[8]。也有研究认为MMP11能有效调节肿瘤间质的微血管新生[9]。MMP11在肿瘤病变过程中能降解非细胞外基质的丝氨酸蛋白酶抑制剂和胰岛素样生长因子结合蛋白-1，在细胞内以45 kDa的活化酶形式进行释放，在细胞外被激活，调控下游蛋白的表达。细胞间的黏附作用常与MMP11关系密切，其可以使肿瘤细胞间的连接松动，使细胞脱离原发灶，进而形成转移灶[10]。SIX1和SIX2属于肿瘤促进因子，可以作为转录因子参与多种组织的形成和发育。有研究发现，SIX1在正常成熟组织中的表达水平较低，而在恶变组织中的表达水平明显升高；另外，SIX1转录时能够调控多种促癌基因的表达和肿瘤细胞的增殖[11-12]。有研究认为，SIX1能够调节转化生长因子信号通路的过表达，激活血管内皮生长因子，有效调控肿瘤间质的脉管生成；SIX1能够抑制上皮细胞的黏附作用和细胞间的结合程度，促进肿瘤的增殖、浸润和转移[13]。SIX2还具有调控上皮-间充质转化的作用，能够使肿瘤浸润的前沿枝芽状的细胞表达波形蛋白（vimentin）等标志物，进而增强肿瘤细胞和间质细胞的同源性。SIX1对肿瘤的调控作用还表现在对MMP的调节方面，其能够抑制间质的转移屏障作用，使肿瘤细胞发生转移[14]。SIX2还能够通过调控B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白等的表达从而发挥抑制肿瘤细胞凋亡的作用。因此，与SIX1相比，SIX2的作用可能更加广泛，其调控肿瘤进展的作用通路更多[15]。

本研究结果显示，不同宫颈病变组织中SIX1、SIX2和MMP11的阳性表达率比较，差异均有统计学意义（P＜0.01），提示SIX1、SIX2和MMP11参与宫颈病变的发生与发展。本研究结果显示，宫颈鳞状细胞癌组织中SIX1、SIX2和MMP11的表达情况可能与肿瘤最大径和淋巴结转移的关系最大，提示SIX1、SIX2和MMP11可以促进宫颈鳞状细胞癌的生长和转移。肿瘤细胞呈树根状向周围组织生长，对局部组织和周围邻近器官具有明显的破坏作用。本研究结果显示，宫颈病变组织中SIX1和SIX2的阳性表达率可能与增殖指数有关，MMP11的阳性表达率可能与脉管瘤栓情况有关，提示SIX1和SIX2能够促进宫颈鳞状细胞癌细胞的增殖，MMP11能够促进宫颈鳞状细胞癌组织的脉管侵犯。Pearson相关性分析结果显示，宫颈鳞状细胞癌组织中SIX1和MMP11、SIX2和MMP11的表达均呈正相关（r=0.55、0.49，P＜0.05），提示SIX1、SIX2可能通过调节MMP11的表达从而发挥促进宫颈鳞状细胞癌细胞转移的作用。由于以上因素均与肿瘤的生物学行为相关，因此，三者的异常表达预示着宫颈鳞状细胞癌不良生物学行为的发生。这为临床提供了辅助判断宫颈鳞状细胞癌生物学行为的指标，也为宫颈鳞状细胞癌患者个体化治疗的实施提供了支持。有研究发现，SIX家族通过对MMP11进行调控，调节肿瘤的生长和侵袭过程[16-17]。本研究发现SIX1和SIX2的表达与脉管癌栓无明显相关性，提示二者对脉管的浸润作用不明显，但是其具体机制尚需要更多的实验加以证实[18-19]。应用其他实验手段检测SIX1和SIX2的表达也是验证其与宫颈鳞状细胞癌细胞发生转移关系的重要手段。

综上所述，SIX1、SIX2和MMP11在宫颈鳞状细胞癌组织中的阳性表达率高，SIX1、SIX2的阳性表达率可能与宫颈鳞状细胞癌的肿瘤最大径、淋巴结转移情况、增殖指数有关，MMP11的阳性表达率可能与宫颈鳞状细胞癌的肿瘤最大径、淋巴结转移情况、脉管瘤栓情况有关。SIX1、SIX2和MMP11对宫颈鳞状细胞癌的发生、发展具有一定的调节作用。SIX1和SIX2可能通过调控MMP11对宫颈鳞状细胞癌的发生、发展起到一定的调节作用。SIX1、SIX2和MMP11的表达可能在宫颈鳞状细胞癌患者预后的判断中具有一定的参考价值。本研究主要侧重于对SIX1、SIX2和MMP11蛋白的表达情况进行研究，其mRNA的改变可能与蛋白的表达具有协同作用，后续研究应针对SIX1mRNA、SIX2mRNA和MMP11mRNA的表达进行实验设计，对阐明SIX1、SIX2与MMP11的关联性及其作用机制将具有更大的意义。