miRNA-27、Oct4、SOX2在口腔鳞状细胞癌组织中的表达及其与患者临床特征和预后的关系

刘晶，李福军，冯琦，孙昕

河南科技大学第一附属医院1口腔科，2肿瘤科，河南 洛阳 471000

肿瘤干细胞和胚胎干细胞均具有维持细胞自我更新能力的特性，提示两者之间可能存在某种相同的分子结构[1]。八聚体结合转录因子4（octamer binding transcription factor 4，Oct4）和性别决定区Y框蛋白2（sex determining region Y-box 2，SOX2）均属于典型的胚胎干细胞转录因子和分子标志物。近年来，众多学者还发现Oct4和SOX2在舌鳞状细胞癌[2]、宫颈癌[3]等多种肿瘤组织中呈高表达，具有类似原癌基因的活性，通过影响组蛋白或DNA甲基化，调节染色质状态和开放程度，从而实现诱导和维持肿瘤干细胞的多能性。此外还有学者提出，SOX2和Oct4可同时被某些相同的基因所调控。例如，Chen等[4]发现微小RNA（microRNA，miRNA）-221可同时抑制SOX2、Oct4在小鼠胚胎干细胞中的表达。而Fuchs等[5]则提出SOX2、Oct4在胚胎癌细胞中表达上调，并且受miRNA-27的负性调控。miRNA是一类广泛存在于真核细胞中的非编码小分子RNA，具有稳定的保守序列，可作为口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）诊疗中的敏感分子标志物。基于上述理论分析，本研究通过检测OSCC组织中miRNA-27、SOX2、Oct4的表达水平，并分析其与患者临床特征及预后的关系，旨在为OSCC的临床诊断和个体化治疗提供理论依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2012年10月至2013年12月于河南科技大学第一附属医院就诊并接受手术治疗的OSCC患者。纳入标准：①经病理检查首次确诊为原发性OSCC；②术前未进行放疗、化疗及其他抗肿瘤治疗；③临床和随访资料完整。排除标准：合并代谢系统疾病、急慢性感染、严重肝肾功能障碍、心脑血管疾病或其他可能干扰miRNA-27、Oct4、SOX2表达的疾病。依据纳入和排除标准，本研究共纳入116例OSCC患者，其中，男71例，女45例；年龄18～78岁，中位年龄为57岁，平均年龄为（54.31±16.17）岁；根据国际抗癌联盟（International Union Against Cancer，UICC）和美国癌症联合委员会（American Joint Committee on Cancer，AJCC）颁布的肿瘤TNM分期（第7版）标准[6]：Ⅰ期58例，Ⅱ期35例，Ⅲ期23例。另选取同期于河南科技大学第一附属医院接受手术治疗的口腔良性疾病患者。纳入标准：经手术确诊为口腔良性疾病。排除标准：合并代谢系统疾病、急慢性感染、严重肝肾功能障碍、心脑血管疾病。依据纳入和排除标准，本研究共纳入40例口腔良性疾病患者，其中口腔白斑患者20例，口腔扁平苔藓患者16例，单纯舌肥大患者4例。40例口腔良性疾病患者中，男23例，女17例；年龄20～79岁，平均年龄为（53.35±15.80）岁。OSCC患者和口腔良性病变患者的性别、平均年龄比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。收集116例OSCC患者的OSCC组织及40例口腔良性疾病患者的口腔良性病变组织。

1.2 主要试剂和仪器

Trizol试剂盒、One Step PrimeScript® miRNA cDNA Synthesis Kit均购自美国Invitrogen公司；mirPremier® microRNA Isolation Kit、SYBR Green PCR master Mix均购自日本Takara公司；兔抗人SOX2单克隆抗体、兔抗人Oct4多克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司；免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（streptavidin-perosidase，SP）法试剂盒、二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。NanoDrop-1000分光光度计购自美国NanoDrop公司；iQ5 Real-time PCR System购自美国Bio-Rad公司；RM2135石蜡切片机购自德国Leica公司；Image Pro Plus图像处理分析软件购自美国Media Cybernetics公司。

1.3 实验方法

1.3.1 组织RNA提取 采用Trizol法提取各组织标本中的总RNA，并检测260 nm和280 nm波长下的吸光度值（A）。当 A260/A280为 1.6～1.8时，说明RNA纯度较高。

1.3.2 miRNA-27的相对表达量 以逆转录合成的反向转录DNA（cDNA）作为模板，以小分子U6作为内参进行实时定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）。冰浴中配制20μl PCR反应体系，反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循环42次；60 ℃ 5 min终止反应。miRNA-27上游引物为5'-ACAGCTGCTCCAGTCCTGGTCA-3'，下游引物为5'-CTGGTGTCACTACATCTAAGAGTC-3'。根据使用说明调整基线，将阈值设定在荧光值对数图的线性部分，从软件中读取Ct值。以2-ΔΔCt表示目的基因的相对表达量。

1.3.3 免疫组织化学染色法检测Oct4和SOX2蛋白的表达情况 将组织切片逐步进行二甲苯脱蜡（二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各5 min）和梯度乙醇水化（100%乙醇和95%乙醇各5 min），然后加入柠檬酸钠缓冲液进行组织抗原修复，冷却至室温；滴加Oct4抗体或SOX2抗体（1∶100稀释），4℃孵育过夜；滴加二抗，室温下孵育1 h，洗涤；加入DAB（按照DAB显色试剂盒说明书进行操作）染色5 min；脱水后，采用中性树胶封片。室温下干燥48 h后，由两位以上病理科副主任医师读片并分析免疫组织化学染色结果。

1.4 结果判断

1.4.1 miRNA-27表达情况 2-ΔΔCt＞中位值则为高表达，否则为低表达。

1.4.2 Oct4和SOX2蛋白表达情况 Oct4和SOX2蛋白阳性染色主要位于细胞质内，细胞质内有棕色或棕黄色颗粒为阳性表达，少数阳性染色细胞见于细胞核内。每张切片随机取10个高倍视野（×400），每个视野分别计数100个细胞。依据阳性细胞所占百分比进行评分：＜5%为0分，≥5%为1分。依据染色强度进行评分：无着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色或深褐色为2分。阳性细胞所占百分比评分与染色强度评分相乘，0分为阴性，1～2分为阳性。使用Image Pro Plus软件对其进行定量分析，并记录结果。

1.5 随访及疗效评估

结合复诊病历，利用电话、电子通讯等手段对患者及其家属进行随访，随访截至2018年12月30日。总生存时间（overall survival，OS）为患者出院当日至随访截止时间或患者死亡时间。

1.6 统计学方法

采用SPSS 18.0软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，组间比较采用Log-rank检验；采用Cox比例风险回归模型对OSCC患者5年生存率的影响因素进行单因素和多因素分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA-27、Oct4蛋白、SOX2蛋白表达情况的比较

经实时定量PCR检测，OSCC组织中miRNA-27的相对表达量为（0.283±0.076），明显低于口腔良性病变组织的（0.455±0.072），差异有统计学意义（t=12.506，P＜0.01）。OSCC组织中Oct4蛋白、SOX2蛋白的阳性表达率分别为62.07%（72/116）、56.03%（65/116），均高于口腔良性病变组织的35.00%（14/40）、37.50%（15/40），差异均有统计学意义（χ2=8.810、4.090，P＜0.05）。（图1、图2）

图1 OSCC 组织和口腔良性病变组织中miRNA-27的表达情况

图2 OSCC 组织和口腔良性病变组织中Oct4蛋白、SOX2蛋白的表达情况（免疫组织化学染色，×400）

2.2 不同临床特征OSCC患者OSCC组织中miRNA-27、Oct4蛋白、SOX2蛋白表达情况的比较

OSCC患者OSCC组织中miRNA-27相对表达量的中位值为0.285，其中59例患者的miRNA-27相对表达量≤0.285，即呈低表达。不同吸烟史、分化程度、TNM分期、T分期、N分期的OSCC患者OSCC组织中miRNA-27的低表达率比较，差异均有统计学意义（χ2=4.545、8.712、10.950、7.204、6.829，P＜0.05）。不同吸烟史、TNM分期、N分期的OSCC患者OSCC组织中Oct4蛋白的阳性表达率比较，差异均有统计学意义（χ2=14.941、14.908、5.047，P＜0.05）。不同TNM分期OSCC患者OSCC组织中SOX2蛋白的阳性表达率比较，差异有统计学意义（χ2=12.305，P＜0.05）。而不同性别、年龄、肿瘤部位的OSCC患者OSCC组织中miRNA-27的低表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；不同性别、年龄、肿瘤部位、分化程度、T分期的OSCC患者OSCC组织中Oct4蛋白的阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；不同性别、年龄、肿瘤部位、吸烟史、分化程度、T分期、N分期的OSCC患者OSCC组织中SOX2蛋白的阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表1）

表1 不同临床特征OSCC患者OSCC组织中miRNA-27、Oct4蛋白、SOX2蛋白的表达情况（n=116）

2.3 miRNA-27、Oct4蛋白、SOX2蛋白表达情况与OSCC患者预后的关系

OSCC患者的随访时间为6～68个月，中位随访时间为62个月，无失访病例。OSCC患者的5年生存率为62.93%（73/116）。Log-rank检验结果显示，miRNA-27低表达患者的5年生存率明显低于miRNA-27高表达患者，miRNA-27低表达+Oct4阳性表达+SOX2阳性表达患者的5年生存率明显低于其他患者，差异均有统计学意义（P＜0.01）；而不同Oct4蛋白及SOX2蛋白表达情况患者的5年生存率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表2）

表2 miRNA-27、Oct4蛋白、SOX2蛋白表达情况与OSCC患者预后的关系（n=116）

2.4 OSCC患者5年生存率影响因素的Cox比例风险回归分析

以性别、年龄、肿瘤部位、吸烟史、分化程度、TNM分期、T分期、N分期、miRNA-27表达情况、Oct4蛋白表达情况、SOX2蛋白表达情况为自变量，以OSCC患者的5年生存率为因变量，采用Cox比例风险回归模型进行单因素和多因素分析，结果显示，有吸烟史、TNM分期为Ⅲ期、N分期为N2～3期均是OSCC患者5年生存率的独立危险因素，而miRNA-27高表达是OSCC患者5年生存率的独立保护因素（P＜0.05）。（表3）

表3 116例OSCC患者5年生存率影响因素的单因素和多因素分析

3 讨论

相较于正常细胞，肿瘤干细胞起源于分化良好的体细胞的去分化，具有无限增殖能力和持续自我更新能力，这些特点与胚胎干细胞极其相似。因此有学者提出可以从胚胎干细胞角度寻找与肿瘤发生相关的靶分子[7]。Oct4和SOX2属于典型的胚胎干细胞转录因子，同时也是维持干细胞多潜能性和自我更新的两个关键核心调控因子[8]。通过形成Oct4-SOX2异二聚体复合物，结合胚胎干细胞关键因子NANOG及自身启动子，或者与NANOG下游靶基因[如成纤维细胞生长因子4（fibroblast growth factor 4，FGF4）、未分化胚胎干细胞转录因子1（undifferentiated embryonic cell transcription factor 1，UTF1）等]的启动子区域相结合，形成复杂的调控网络。2005年，Taranger等[9]提出肿瘤干细胞与胚胎干细胞具有类似的分化特性。随后，Saigusa等[10]也证实Oct4和SOX2不仅高表达于胚胎干细胞，同时在结肠癌组织中也呈高表达。Fu等[11]学者发现Oct4蛋白和SOX2蛋白在OSCC组织中的表达水平高于正常口腔黏膜组织，这与本研究的结果基本一致。

口腔扁平苔藓和口腔白斑属于口腔癌前病变和癌前病损的典型疾病类型，但并非所有癌前病变患者均会进展为口腔癌，因此寻找敏感性较高的分子标志物用于筛选高危患者同样具有重要的临床意义。基于病理学分析，口腔扁平苔藓患者多以固有层淋巴细胞浸润及上皮基底细胞液化为主要特征，口腔白斑患者则主要表现为上皮过角化、不全角化和不典型增生；上述这些临床特征均会导致口腔黏膜的溃疡和糜烂。有学者曾提出，口腔黏膜上皮细胞对溃疡和糜烂的修复正是依靠成体干细胞的自我更新和特异分化能力[12]。Adorno-Cruz等[13]学者认为口腔上皮内成体干细胞的这种修复作用引起的上皮细胞内重编程是口腔黏膜上皮癌变的主要诱因，而Oct4和SOX2在此过程中发挥着关键作用。基于上述理论分析，本研究对比了OSCC组织和口腔良性病变组织中Oct4和SOX2蛋白表达的差异，结果发现，OSCC组织中Oct4和SOX2蛋白的阳性表达率均高于口腔良性病变组织，并且本研究结果还表明，Oct4蛋白表达可能与吸烟史、TNM分期、N分期有关，而SOX2蛋白表达可能与TNM分期有关，但是两者与OSCC患者预后的关系并不密切。

此外，miRNA也是调控肿瘤干细胞功能的关键因素。相对于肿瘤组织中的蛋白分子，miRNA的稳定性更高、调控范围更广。在前期实验中，作者通过检索PubMed、TargetScan等数据库发现，多种miRNA可结合于Oct4和SOX2基因信使RNA（messenger RNA，mRNA）的3'末端非编码区，进而调控Oct4和SOX2基因的转录和翻译。Chinnathambi等[14]研究发现，在胚胎干细胞中miRNA-145的表达量与Oct4的表达量呈负相关。Tabrizi等[15]研究证实，miRNA-302b通过上调“干性”标志物Oct4和SOX2的表达促进结肠癌细胞HT-29的增殖，从而维持结肠癌细胞的“干性”和多潜能性。Fuchs等[5]建立了Oct4基因和SOX2基因沉默的肿瘤细胞模型，结果提示miRNA-27与Oct4、SOX2的表达呈负相关。考虑到miRNA表达变化是癌变发生的早期事件，因此本研究对miRNA-27的表达量进行分析，结果显示，miRNA-27在OSCC组织中的相对表达量较低，且可能与吸烟史、分化程度、TNM分期、T分期、N分期及5年生存率有关。提示miRNA-27的表达水平与肿瘤干细胞的增殖、分化等生物学行为可能具有某种关联，可靶向调控某些干细胞特异性标志基因（如Oct4和SOX2）对细胞形态学变化的诱导作用，从而抑制肿瘤的发生、发展。本研究的多因素分析结果显示，有吸烟史、TNM分期为Ⅲ期、N分期为N2～3期均是OSCC患者5年生存率的独立危险因素，而miRNA-27高表达是OSCC患者5年生存率的独立保护因素。

综上所述，OSCC组织中miRNA-27的相对表达量较低，而Oct4蛋白、SOX2蛋白的阳性表达率较高，三者之间可能具有某种调控关系。对于同时出现miRNA-27低表达且Oct4蛋白和SOX2蛋白均阳性表达的OSCC患者，建议临床密切随访。