5-氟尿嘧啶对结肠癌干细胞干性和增殖的影响及相关机制

蔡尚党 蔡满地 娄宁 郭艳萍 殷涛

(1河南省中医院肛肠科，河南 郑州 450002；2河南大学医学院临床医学系；3中山大学附属肿瘤医院ICU；4河南省人民医院病理科；5华中科技大学同济医学院附属协和医院胰腺病研究所)

结肠癌是世界范围内第三常见的癌症，每年造成约70万人死亡〔1～3〕。在过去的二十年中，该病在发展中国家的发病率增加了2～4倍〔4,5〕，手术切除和辅助化疗是治疗结肠癌的主要方法，然而原发性或获得性药物抗性是该病成功治愈的主要挑战〔6〕。因此，亟待开发新的治疗策略或新的辅助药物以增强该病的治疗效果。5-氟尿嘧啶(FU)是一种细胞生长抑制剂，是最常用的治疗结肠癌的药物，然而，对晚期结肠癌5-FU化疗的有效率仅有20%左右，5-FU和如伊立替康及奥沙利铂等新的化疗药物的联合使用提高了5-FU对结肠癌的治疗效果〔7〕，在5-FU的代谢途径中，包括胸苷酸合成酶、甲基四氢叶酸还原酶、二氢嘧啶脱氢酶和胸苷磷酸化酶在内的四种酶被认为与5-FU的治疗敏感性和抗性密切相关，然而，许多研究结果相互矛盾〔8〕。最近，胰岛素样生长因子信号通路被证明对于结肠癌的发育至关重要，其能通过激活如PI3K/Akt等存活通路而有利于结肠癌细胞的存活、侵染、转移和化疗抗性〔9～12〕。本研究探讨5-FU对结肠癌干细胞(CCSCs)干性和增殖的影响及可能机制。

1 材料与方法

1.1CCSCs 标记CD133、CD44和ALDH1b1阳性的CCSCs购自美国Celprogen公司。为维持上述细胞的未分化状态，培养过程中使用CCSCs生长培养基和特异性包被的细胞培养皿，细胞培养于37℃，5%CO2湿润培养箱中，当细胞达到80%汇合度时，用于实验。所有实验所用细胞代次低于10代。细胞分为阴性对照组、DMSO组、舒林酸组、5-FU组。

1.2主要仪器及试剂 5-FU(Sigma，美国)，兔抗人Bax、Bcl-2、cyclinD1和c-Myc抗体，鼠抗人α-tubulin抗体(Sigma，美国)，兔抗人细胞色素c抗体(Sigma，美国)，兔抗人Histone抗体(Cell Signaling Technology，美国)，辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔/鼠IgG(Abcam，美国)，嘌呤霉素(Sigma，美国)，p53特异性shRNA质粒(Santa Cruz，美国)，5-溴-2'-脱氧尿苷(BrdU)检测试剂盒(Cell Signaling Technology，美国)，细胞死亡检测试剂盒(Roche，德国)，电化学发光(ECL)显色试剂盒(碧云天生物技术研究所，中国)，CO2培养箱(SANYO，日本)，相差显微镜(Olympus，日本)。

1.3介导p53敲低表达的重组慢病毒短发夹RNA(shRNA)载体 CCSCs接种含靶向p53基因特异性shRNA的慢病毒颗粒，在含有5 μg/ml凝聚胺的CCSC培养基中培养的CCSCs接种10 MOI的慢病毒，慢病毒感染后24 h，更换新鲜培养基，细胞继续培养2 d后，在含有7.5 μg/ml嘌呤霉素的选择性培养基中加压筛选5 d。

1.4细胞增殖检测 BrdU检测试剂盒检测细胞活性，正常CCSCs或shRNA-p53 CSCs以1×105个/孔的密度铺板于12孔板中，培养24 h后，更换为不含血清的CCSCs培养基，并经10 μg/ml舒林酸或2.5 μg/ml 5-FU处理，处理24 h后，检测BrdU含量，实验重复3次，结果以均值表示。

1.5末端转移酶dUTP切口末端标记检测 使用荧光标记的核苷酸和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)鉴定细胞凋亡产生的DNA片段。6×104个正常CCSCs或shRNA-p53-CCSCs接种于玻璃载玻片上，经10 μg/ml舒林酸或2.5 μg/ml 5-FU处理12 h后，根据说明书的要求，使用原位细胞死亡检测试剂盒定量检测细胞凋亡情况，同时用不含TdT的孵育液孵育的样品作为阴性对照，计数5个视野内的染色细胞数目，计算凋亡细胞比例，每次至少计数50个细胞，实验重复3次，结果以均值表示。

1.6球体形成实验 1×104个CCSCs用干细胞特异性的不含血清的培养基培养于超低吸附性的6孔培养板中，然后将细胞置于正常细胞培养箱中，细胞接种于6孔板后6 h，加入10 μg/ml舒林酸或2.5 μg/ml 5-FU，处理10 d后，使用相差显微镜计数球体数量，实验重复3次，结果以均值表示。

1.7Western印迹检测 正常CCSCs或shRNA-p53-CCSCs以3.0×105个/孔的密度铺于6孔板中，用CCSCs培养基培养，24 h后，细胞转移至无血清培养基中孵育18 h，提取细胞样品的总蛋白，并将总蛋白转移至PVDF膜上，孵育一抗，一抗稀释比例为：兔抗人Bax、Bcl-2、cyclinD1和c-Myc抗体1∶1 000稀释，鼠抗人α-tubulin抗体1∶5 000稀释，兔抗人细胞色素c抗体1∶1 000稀释，兔抗人Histone抗体1∶2 000稀释。一抗4℃孵育过夜，然后，HRP标记的羊抗兔/鼠二抗以1∶2 000的比例稀释，室温孵育2 h，目的蛋白用增强型ECL化学发光液显色，并经BandScan软件进行灰度扫描分析，α-tubulin作为总蛋白检测时上样的内参蛋白，而Histone作为细胞核蛋白检测时上样的内参蛋白。

1.8统计学方法 采用GraphPad Prism5软件进行t检验或单因素方差分析。

2 结 果

2.15-FU抑制CCSCs增殖并诱导凋亡 对阴性照组相比，5-FU的浓度为2.5 μg/ml时，正常CCSCs的增殖速率下降了52%，而shRNA-p53-CCSCs增殖速率下降了73%，10 μg/ml的舒林酸处理导致正常CCSCs增殖速率下降了47%，然而，敲低CCSCs中p53表达后，舒林酸对CCSCs增殖的抑制效应较未敲低时强(51%)，表明舒林酸对CCSCs的增殖抑制效应具有p53依赖性。使用TUNEL法检测细胞凋亡情况结果表明，5-FU处理后，正常CCSCs凋亡率为31%，shRNA-p53-CCSCs凋亡率为42%，表明5-FU能以p53非依赖性方式抑制结肠CSCs增殖，见表1，表2，图1。

2.25-FU抑制CCSCs球体形成能力 CCSCs经2.5 μg/ml 5-FU或10 μg/ml舒林酸处理后，5-FU和舒林酸均显著抑制CCSCs球体形成，与阴性对照组相比，5-FU和舒林酸处理组球体体积显著下降，结果表明，5-FU除了能抑制CCSCs增殖并促进凋亡外，其还能抑制CCSCs的自我更新能力，见图2。

表1 正常CCSCs与转染shRNA-p53对细胞增殖的影响

与阴性对照组比较：1)P<0.05，下表同

表2 正常CCSCs与转染shRNA-p53对细胞凋亡率的影响

图1 5-FU以p53非依赖性方式抑制CCSCs增殖并诱导细胞凋亡(×300)

图2 5-FU抑制CCSCs球体形成(×300)

2.35-FU促进线粒体介导的凋亡途径相关蛋白Bax/Bcl-2和细胞色素c表达 正常CCSCs和shRNA-p53-CCSCs经5-FU处理后，细胞裂解产物用于Western印迹检测，5-FU处理后正常CCSCs中Bax/Bcl-2比例显著升高，同时，5-FU处理也促进了正常CCSCs和shRNA-p53-CCSCs中细胞色素c表达，表明5-FU可能通过线粒体介导的凋亡途径诱导CCSCs凋亡，尽管舒林酸诱导CCSCs凋亡，但未使细胞中Bax/Bcl-2比例，明显改变但可以促进细胞色素c表达。见图3、表3。

1～4：阴性对照组，DMSO组，舒林酸组，5-FU组，下图同图3 5-FU上调线粒体介导的细胞凋亡途径蛋白表达

表3 5-FU上调线粒体介导的细胞凋亡途径蛋白表达

与阴性对照组比较：1)P<0.01，2)P<0.001

2.45-FU抑制Wnt信号通路活化 正常CCSCs和shRNA-p53-CCSCs中，5-FU抑制胞质和胞核中β-连环蛋白表达，且其抑制效应显著强于舒林酸的抑制效应(图4，表4)。5-FU能够抑制β-连环蛋白通路下游靶蛋白c-Myc和cyclinD1的表达(图5，表5)，上述结果表明5-FU能抑制β-连环蛋白的核转位，进而导致CCSCs生长受到抑制。

图4 5-FU抑制正常CCSCs和shRNA-p53-CCSCs胞质和胞核内β-连环蛋白表达

表4 5-FU抑制正常CCSCs和shRNA-p53-CCSCs胞质和胞核内β-连环蛋白表达

与阴性对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001，下表同

图5 5-FU抑制正常CCSCs和shRNA-p53-CCSCs中β-连环蛋白的靶蛋白c-Myc和cyclinD1表达

表5 5-FU抑制正常CCSCs和shRNA-p53-CCSCs中β-连环蛋白的靶蛋白c-Myc和cyclinD1表达

3 讨 论

本研究表明5-FU可能以非p53依赖性方式发挥作用，5-FU也能上调与线粒体介导的凋亡途径相关的蛋白表达，同时下调与Wnt/β-连环蛋白信号通路有关的蛋白表达，5-FU的浓度为2.5 μg/ml时抑制CCSCs增殖并诱导细胞凋亡；然而舒林酸诱导的上述效应与p53有关。以往研究表明，在AOM诱导的p53功能缺陷型鼠模型中，舒林酸的功能具有p53依赖性〔14～16〕，与p53+/+小鼠相比，舒林酸在p53-/-缺陷型小鼠中不能恢复急性凋亡反应，上述现象是至关重要的，因为在结肠癌晚期或转移性阶段，p53会发生突变〔17〕。5-FU诱导CCSCs发生凋亡的同时，Bax/Bcl-2比例和细胞色素c的表达也升高。Bax是一种促凋亡蛋白，其能结合于Bcl-2并促进细胞色素c释放，细胞色素c是线粒体介导的凋亡途径的重要分子〔18,19〕。这些结果表明，5-FU通过线粒体介导的凋亡途径诱导CCSCs凋亡，本研究结果也证实5-FU抑制球体形成，因为克隆球体的形成是干细胞干性的重要特征，本研究表明5-FU具有潜在的靶向CCSCs自我更新的潜能。本文中5-FU处理导致正常CCSCs和shRNA-p53-CCSCs中β-连环蛋白的表达受到抑制，β-连环蛋白的稳定表达及其在胞核中的积累伴随着c-Myc和cyclinD1的转录激活，这些基因的转录激活能促进细胞增殖而增加致癌性〔20～22〕，5-FU处理后的CCSCs能抑制c-Myc和cyclinD1表达，且这种抑制效应不依赖于p53。

CCSCs的一些特征可能解释5-FU抑制干细胞干性的原因，干细胞表达高水平的干性因子，其中包括肿瘤蛋白c-Myc〔23〕，该蛋白在CCSCs中过度表达〔24〕。本研究表明，体外5-FU能抑制CCSCs中Wnt效应因子β-连环蛋白和下游靶蛋白c-Myc和cyclinD1表达。因此，相对于可分化细胞的致癌性变化，干细胞致癌性变化，如β-连环蛋白积累，可能对5-FU诱导的凋亡更敏感。