高糖对蜂蜜中鲁氏接合酵母生理特性的影响

李玉洁 陈鑫超 徐晓兰, 缪晓青, 吴珍红,

（1 福建农林大学食品科学学院，福州 350002；2 福建农林大学蜂疗研究所，福州 350002；3 天然生物毒素国家地方联合工程实验室，福州 350002）

蜂蜜是一种天然、粘稠、稳定的甜味剂[1]，主要由糖类（7 0%～8 5%）组成，其中大部分（85%～95%）是单糖，即果糖和葡萄糖[2]，此外，蜂蜜含有少量微量成分，如蛋白质、矿物质、酶、维生素、有机酸和酚类化合物[3-5]。蜂蜜具有渗透压高、pH低、粘度高、含有抗菌物质等特性[6-9]，因此，蜂蜜中的微生物较少，只生长嗜渗透和耐渗透的微生物，主要为芽孢杆菌、肉毒杆菌和酵母菌。

大多数天然蜂蜜样品含有可检测水平的酵母[10]，酵母菌的生长代谢会消耗蜂蜜中的单糖，将其转化为二氧化碳和乙醇，导致蜂蜜发酵，并降低蜂蜜的营养价值[11]，但酵母菌在高渗透压下能够通过渗透调节系统缓解高渗胁迫，聚集多种代谢物为渗透压保护物质[12]，如甘油、海藻糖、D-阿拉伯糖醇、赤藓糖醇等物质[13]，可作为发酵工程菌。本文从鸭脚木蜂蜜中分离鉴定出鲁氏接合酵母，研究高糖对其生长和氧化酶活力的影响，从而了解鲁氏接合酵母在不同高糖浓度下的生理特性，为筛选耐糖工程菌提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

鸭脚木蜜采自福建省泉州市惠安县凌溪水库。

蛋白胨、酵母提取物购自OXOID公司，无水葡萄糖、甘油购自国药有限公司，氯硝胺18%甘油琼脂、氯霉素购自青岛海博生物技术有限公司，DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司，SOD、POD、CAT、BCA法蛋白定量测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所，色谱级乙腈购于默克公司，葡萄糖标准品购自TMstandard公司，果糖、麦芽糖、蔗糖标准品购于上海源叶生物科技有限公司。

HZQ-F100全温振荡培养箱（苏州培英），Q5000超微量紫外可见分光光度计（美国Quawell公司），G154DS自动压力蒸汽灭菌锅（厦门致微），Infinite 200Pro 酶标仪（Tecan），SW-CJ-2FD型超净工作台（苏州净化）。

1.2 培养基配制

YPD培养基：对照培养基，10g/l的酵母提取物，20g/l蛋白胨，20g/l葡萄糖，自然pH值，12l ℃灭菌20min。

高糖培养基：10g/l酵母提取物，20g/l蛋白胨，分别添加300g/l、400g/l、500g/l、600g/l葡萄糖，自然pH值，12l ℃灭菌20min。

1.3 蜂蜜中酵母菌的分离

根据GB14963-2011，用30%葡萄糖溶液对蜂蜜样品进行10倍梯度稀释后，取0.2ml涂布于氯硝胺18%甘油琼脂（DG18）上，在30℃下培养7d，挑取形态符合酵母菌菌落且具有代表性的单菌落，在30%葡萄糖液体培养基中30℃、180r/min摇培3d。

1.4 ITS鉴定

根据酵母菌D N A 提取试剂盒提取酵母菌D N A。使用I T S 1 和I T S 4 引物（正向引物：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和反向引物：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）进行PCR扩增，PCR反应条件如下：预变性温度94℃，3min；变性温度94℃，40sec；退火温度60℃，45sec；延伸温度72℃，45sec；复性温度72℃，10min；40个循环，保存温度4℃。PCR体系为25μl，体系如下：2×Taq PCR masterMix，12.5μl；Primer F（10μmol/l），1μl；Primer R（10μmol/l），1μl；DNA模版，80～100ng；加ddH2O至25μl。之后将PCR产物送于上海生工生物工程有限公司进行测序。运用BLAST工具，将得到的ITS序列与GenBank数据库中的已有序列进行比对分析，分析分离酵母菌与已知酵母菌序列的同源性，鉴定分离酵母菌的种属。

1.5 酵母菌的活化

将酵母菌转接至30%葡萄糖液体培养基中，30℃、180r/min下培养12～16h，活化3次，制备处于指数生长期的酵母悬浮液，菌体密度为2×108CFU/ml[14]，以此作为种子液。

1.6 生长曲线测定

按7%的接种量接入已灭菌的YPD对照培养基，300g/l、400g/l、500g/l、600g/l高糖培养基中，30℃下180r/min摇培，每8h用超微量紫外可见分光光度计测定培养基在600nm处的光密度值[15]。

1.7 培养基中残糖量和蜂蜜中糖含量的测定

参照GB5009.8-2016《食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定》，每8h测定一次培养基中葡萄糖的含量，同时测定鸭脚木蜜中的葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖含量。在配备有示差折光检测器（RID）和氨基柱（InterSustain NH2，4.6mm×250mm，5μm）的高效液相色谱仪（岛津）中测定培养基和蜂蜜中的糖含量。乙腈水溶液作流动相，乙腈与水的比例为70:30（v/v），流速为1ml/min，进样量为20μl，柱温为40℃。

1.8 酶活力测定

取培养至24h时的培养液，9000r/min，4℃离心酵母菌10min，用PBS洗涤4次，酵母菌再溶于PBS中至浓度为2×109CFU/ml，在液氮和水浴中反复冻融三次（在液氮中5min，在37℃中10min）[17]，酵母冻融后4℃、14000r/min离心10min，取上清液用于酶活力的测定，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）活力根据南京建成公司生产的试剂盒进行，同时根据南京建成公司的BCA法蛋白定量测定试剂盒测定上清液的蛋白含量[16]。一个SOD酶活力单位是在反应体系中SOD抑制率达50%时对应的酶量。利用过氧化物酶（POD）催化过氧化氢反应的原理，测定420nm处吸光度的变化得其酶活力，在37℃下，每毫克蛋白每分钟催化1μg底物的酶量定义为一个POD酶活力单位。过氧化氢酶（CAT）分解H2O2的反应可通过加入钼酸铵而中止，剩余的H2O2与钼酸铵作用生成一种淡黄色的络合物，在405nm处测定其变化量得出CAT的活力，每毫克蛋白每秒钟分解1μmol的H2O2的量为一个CAT酶活力单位[18]。

1.9 数据分析

所有数据采用SPSS 24.0软件分析。结果用平均值±标准误差表示，单因素ANOVA分析用于显著性分析，p＜0.05表示有统计学显著差异，p＜0.01表示有统计学极显著差异。

2 结果与分析

2.1 ITS鉴定结果

图1为鲁氏接合酵母在DG18培养基上的形态特征，菌落呈圆形，形状厚且大，表面湿润，乳白色，边缘整齐。将ITS序列与GenBank数据库中的已有序列进行比对，与Genbank登录号KY106065.1的同源性为98%，比对结果为Zygosaccharomyces rouxii（鲁氏接合酵母）。

图1 鲁氏接合酵母的形态特征

2.2 蜂蜜中的糖含量

表1为鸭脚木蜂蜜中各种糖类的含量。蜂蜜中果糖和葡萄糖的含量相当，这两种单糖含量占总糖含量的71%，双糖含量为29%。四种糖类含量达68.978g/100g蜂蜜，鲁氏接合酵母可以在蜂蜜中存活，其耐糖量也高达68.978g/100g以上。

2.3 鲁氏接合酵母在不同糖浓度下的生长曲线

图2为鲁氏接合酵母在不同糖浓度下的生长曲线，除在30%的培养基中，酵母菌生长均呈现先增加后稳定的趋势，而在30%的糖浓度下，酵母菌在24h前先快速生长，24～40h内生长速度低于24h前的速度，而40h后酵母菌出现了二次生长。在32h前酵母菌在对照组中的生长速度大于在高糖培养基中的速度，对照组中酵母菌0～24h为生长期，24h后到达了稳定期，而在高糖培养基中的酵母菌的生长期发生了延迟，除30%组，其他3个浓度的培养基48h后才到达稳定期。由此可知随着糖浓度的增加，渗透压增加，酵母菌的生长速率会降低，生长期出现延迟。

图2 鲁氏接合酵母在不同糖浓度下的生长曲线

2.4 不同糖浓度培养基的残糖量

图3为不同糖浓度培养基的残糖量，由图可知，在对照组中，24h后培养基中的葡萄糖含量为0，葡萄糖被消耗殆尽。在高糖组中，随着糖浓度的增加，渗透压增加，酵母菌的糖耗量下降，30%组的糖耗量最高。

图3 不同糖浓度培养基的残糖量

2.5 不同糖浓度下鲁氏接合酵母的SOD活力变化

图4为鲁氏接合酵母在不同糖浓度的培养基中胞内SOD活力的变化。在高糖培养基中，胞内SOD活力较对照组极显著增加（p＜0.01），且在高糖培养基中呈现先增加后降低的趋势，在50%组的酶活力达到最大，为（15.4182±2.7506）U/mg蛋白。30%、40%、50%、60%组的酶活力分别为对照组的1.75倍、3.49倍、4.70倍、4.12倍。

表1 蜂蜜中的糖含量

图4 不同糖浓度下鲁氏接合酵母的SOD活力变化

2.6 不同糖浓度下鲁氏接合酵母的POD活力变化

图5为鲁氏接合酵母在不同糖浓度的培养基中胞内POD活力的变化。由图可知，在30%、40%、50%、60%的培养基中，酵母菌胞内POD的活力都比对照组高，30%、40%组较对照组显著增加（p＜0.05），50%组较对照组极显著增加（p＜0.01），酶活力最大，为（9.5344±1.5518）U/mg蛋白，而60%组与对照组无统计学显著差异（p＞0.05）。30%、40%、50%、60%组培养后的酶活力分别为对照组的1.62倍、1.58倍、1.72倍、1.21倍。

图5 不同糖浓度下鲁氏接合酵母的POD活力变化

2.7 不同糖浓度下鲁氏接合酵母的CAT活力变化

图6 不同糖浓度下鲁氏接合酵母的CAT活力变化

图6为鲁氏接合酵母在不同糖浓度的培养基中胞内CAT活力的变化。由图可知，高糖组酶活力比对照组高，40%与60%组较对照组显著增加（p＜0.05），40%组的酶活力最高，为（6.2238±2.0924）U/mg蛋白。30%、40%、50%、60%组的酶活力分别为对照组的1.24倍、2.41倍、1.95倍、2.39倍。

3 讨论与结论

现有研究已经从蜂蜜中分离出了八孢裂殖酵母、蜂蜜接合酵母、暹罗接合酵母、鲁氏接合酵母以及酿酒酵母等。樊洁等[19]对华北地区的13种蜂蜜的耐高渗酵母菌进行分离鉴定，结果发现蜂蜜中存在有八孢裂殖酵母、蜂蜜接合酵母以及暹罗接合酵母，对其最适生长条件和发酵液的成分进行了研究。浦德雄等[20]从油菜蜂蜜中分离鉴定得到了蜂蜜接合酵母和暹罗接合酵母，研究了其在麦芽汁培养基上的菌落特征和酵母形态。邱巨香等[21]从中蜂蜜和意蜂蜜中分离鉴定出鲁氏接合酵母，观察了其菌落形态。目前关于从蜂蜜中分离鲁氏接合酵母，及其在不同糖浓度下的生理特性变化和氧化酶活力变化的研究较少，本文从鸭脚木蜂蜜中分离酵母菌，经ITS鉴定为鲁氏接合酵母，研究其在YPD培养基、30%、40%、50%、60%的高糖培养基中的生长、耗糖量和氧化酶活力的变化，结果表明：随着初始糖浓度的增加，酵母生长速率降低，对数期延迟，且30%糖浓度下酵母出现二次生长；随着糖浓度的增加，酵母菌的耗糖量降低，30%糖浓度下酵母菌耗糖量最大；与对照组相比，高糖可以促进氧化酶活力的增加，30%、40%、50%、60%糖浓度下的SOD、POD、CAT活力都有不同程度的增加。

本文结果表明，与对照组相比，糖浓度增加，生长速率降低，生长期发生延迟，因为高渗透压会引起细胞脱水，影响胞内正常代谢[22]，因此鲁氏接合酵母生长受到抑制，而在30%组40h后出现二次生长，应是培养基内的葡萄糖含量降低，渗透压降低，酵母菌生长速率增加。王珍珍等[23]从树莓酵素中分离鲁氏接合酵母后对其生长特性进行了研究，发现葡萄糖含量增加，酵母的延滞期也增加。Membre JM等[24]研究了不同糖浓度的合成培养基对鲁氏接合酵母的影响，发现糖浓度从30%增加到80%后，酵母的生长速率也会降低。

在本文中，随着糖浓度的增加，鲁氏接合酵母的糖耗量降低，这是因为高浓度的糖对酵母有葡萄糖阻遏和葡萄糖抑制作用[25]，且高渗透压会导致酵母细胞水分流失，生长速率降低，因此糖浓度越高，糖耗量越低。李晓军等[26]研究了酿酒酵母在高渗胁迫下的生理代谢，发现在高渗培养基中酵母消耗葡萄糖的速率减慢。彭郦等[27]研究低温下高糖对酿酒酵母的影响，发现随着糖浓度的增加，葡萄糖消耗速率降低。

酵母菌受到胁迫时，胞内的氧化还原平衡被打破，内源反应性氧化物会对菌体造成伤害，但氧化酶可以消除自由基，从而保护细胞[28]，因此，本文对鲁氏接合酵母在高糖培养基中三种氧化酶的活力进行测定，发现与对照组相比，三种酶活力都有不同程度的增加，说明这三种氧化物酶对维持胞内正常渗透压起到一定作用[29]。张穗生等[28]研究了酿酒酵母MF1002和呼吸突变株MF11a在高糖胁迫下的生理特性变化，发现在30%葡萄糖培养基中两菌株SOD、POD、CAT、细胞质ATP酶和线粒体ATP酶活力显著上升。Li Chunsheng等[18]研究鲁氏接合酵母在NaCl和Cd胁迫下的生理特性，发现NaCl从2%增加至6%时，SOD、CAT和POD活性显著增加。本文中鲁氏接合酵母在30%至60%的培养基中，SOD、POD、CAT酶活力较对照组都有不同程度的增加，与先前研究结果一致。