后部巩膜F4/80和CD206阳性巨噬细胞在小鼠形觉剥夺性近视发生发展中的变化△

李东辉 龙琴 王静怡 陈晨

近视是指在调节放松状态下，平行光线经眼球屈光系统聚焦在视网膜之前的一种视觉形式，是世界范围内最常见的屈光不正，并且呈逐年上升的趋势，已成为导致视力受损和盲的全球性公共卫生健康问题，然而，到目前为止，其确切的发病机制仍需探索和完善[1-2]。巩膜，尤其是后部巩膜，作为近视相关机制作用下的最终靶组织，始终是近视领域的研究重点[3-4]。前期研究和近期报道提示，近视的发生与全身或眼部炎症具有显著相关性[5-7]，然而，炎症对于近视发生发展是因还是果？炎症通过何种通路促进近视发生和发展呢？目前尚需进一步研究及探讨。巨噬细胞是机体重要的免疫炎症相关细胞，是研究创伤修复、炎症调控和分子免疫的重要对象[8-9]，然而，目前对于巨噬细胞和近视的相关性研究不足。本研究拟通过流式细胞技术检测近视诱导小鼠后部巩膜通用型巨噬细胞标记物F4/80和M2型巨噬细胞标记物CD206的表达，分析F4/80+巨噬细胞和F4/80+/CD206+巨噬细胞的表达以及与小鼠近视发生发展的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物4周龄C57BL/6雄性健康小鼠24只48眼(北京协和医院实验动物中心提供)，在自然照明环境下饲养，自由摄入食水，实验动物的饲养和处理经北京协和医院动物伦理委员会审批通过。

1.1.2 主要试剂与仪器本研究所采用的抗体均购自美国BioLegend公司，具体包括：大鼠抗小鼠F4/80荧光标记抗体(FITC，Cat 123108)及同型对照(FITC标记大鼠IgG2a isotype Ctrl 抗体)；大鼠抗小鼠CD206荧光标记抗体(PE，Cat 141706)及同型对照(PE标记大鼠IgG2a isotype Ctrl 抗体)；流式细胞仪(美国BD LSR II)；200目尼龙网(上海晶安生物科技有限公司，约70 μm孔径)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠形觉剥夺性近视模型的建立C57BL/6小鼠按随机数字表法分别接受形觉剥夺处理和无处理(各12只)，研究分为3组：形觉剥夺组(单眼遮盖，n=12)，自身对照组(对侧眼无遮盖，n=12)，正常对照组(n=12)。形觉剥夺组取右眼为形觉剥夺眼，采用圆形不透光塑料眼罩，直径10 mm，粘贴于小鼠眼球周围(避免胶水流入眼内)，颈部套塑料项圈防止小鼠将眼罩剥离。每天巡视小鼠一次，若眼罩或塑料项圈剥离，及时更换。对侧眼为自身对照眼。正常对照组小鼠不作任何处理(取右眼参与统计分析)。

1.2.2 小鼠屈光度和眼轴检测小鼠实验前(实验0 d)、实验14 d和实验28 d时用5 g·L-1托吡卡胺滴眼液滴眼，每10 min滴眼一次，每次20 μL，共4次。在睫状肌麻痹状态下由有经验的验光师进行带状光检影验光，获得等效球镜屈光度数(球镜屈光度加1/2散光度)。实验14 d和28 d，屈光度检测后采用颈椎脱臼法分别处死6只小鼠分离眼球，清除球周组织，用千分尺测量眼轴长度3次，取平均值。

1.2.3 流式细胞术检测巨噬细胞颈椎脱臼法处死小鼠，迅速分离眼球，清除巩膜外组织，沿锯齿缘将巩膜分为前、后两部，保留后部巩膜组织置于培养皿中，加入消化液，覆盖组织，放入37 ℃恒温箱作用30 min；用一次性注射器针头将组织划碎，用200目尼龙网过滤细胞2次；1000 r·min-1离心5 min弃上清，再用PBS洗涤细胞一次，重悬后计数调节细胞浓度；取106个细胞约100 μL细胞悬液到流式样品管中，加入最佳浓度F4/80 FITC和CD206 PE荧光标记抗体，混匀后室温避光反应20 min；加入PBS清洗2次，混匀后1000 r·min-1离心5 min弃上清；加入500 μL PBS重悬后采用流式细胞仪分析。

1.3 统计学分析采用SPSS 19.0统计学软件和GraphPad Prism 5统计学软件进行分析。数据资料均以均数±标准差表示，用Kolmogorov-Smirnov Test进行数据的正态性分布检验，采用单因素干预随机分组设计，3组各指标的总体差异比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验，实验14 d和实验28 d指标间比较采用独立样本t检验。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 形觉剥夺性近视小鼠模型的诱导情况实验0 d，形觉剥夺组、自身对照组和正常对照组的屈光度分别为(4.94±0.68)D、(5.10±0.51)D和(5.02±0.74)D，3组差异无统计学意义(P>0.05)。实验14 d，3组屈光度和眼轴差异均无统计学意义(均为P>0.05)。实验28 d，3组屈光度和眼轴差异均有统计学意义(均为P<0.05)；实验28 d，形觉剥夺组比自身对照组明显向近视偏移(-3.50±1.18)D，屈光度差异有统计学意义(P=0.001)，并伴有眼轴的显著延长(P=0.02)；形觉剥夺组比正常对照组向近视偏移(-3.45±1.11)D，屈光度差异有统计学意义(P=0.001)；并伴有眼轴的显著延长(P=0.03)；自身对照组和正常对照组的屈光度和眼轴差异均无统计学意义(均为P>0.05)。形觉剥夺28 d比形觉剥夺14 d产生显著的近视偏移(-5.67±0.79)D(t=11.36，P<0.001)，伴眼轴增长(0.16±0.08)mm(t=4.39，P=0.001)，见表1。

组别n屈光度/D实验14 d实验28 d眼轴长度/mm实验14 d实验28 d形觉剥夺组63.92±1.03-1.75±0.65∗#△3.15±0.073.31±0.05∗#△自身对照组64.13±0.611.75±0.823.12±0.173.21±0.05正常对照组64.08±1.041.67±0.563.16±0.113.23±0.07F值0.0950.680.154.45P值0.920.0010.860.03

注：与各自的自身对照组比较，*P<0.05 (单因素方差分析，LSD检验)；与各自正常对照组比较，#P<0.05(单因素方差分析，LSD检验)；与形觉剥夺组实验14 d比较，△P<0.05 (独立样本t检验)

2.2 各组小鼠后部巩膜组织中F4/80和CD206的表达情况实验14 d、28 d，形觉剥夺组、自身对照组和正常对照组相比，形觉剥夺组后部巩膜F4/80阳性(F4/80+)巨噬细胞百分比均显著高于自身对照组和正常对照组(均为P<0.05)。实验14 d，形觉剥夺组后部巩膜F4/80和CD206阳性(F4/80+/CD206+)巨噬细胞百分比均显著高于自身对照组和正常对照组(均为P<0.05)。实验28 d，形觉剥夺组后部巩膜F4/80+/CD206+巨噬细胞百分比均显著高于自身对照组和正常对照组(均为P<0.05)。自身对照组和正常对照组F4/80+和F4/80+/CD206+巨噬细胞百分比在实验14 d、28 d时相比差异均无统计学意义(均为P>0.05)。实验28 d，形觉剥夺组小鼠后部巩膜F4/80+/CD206+巨噬细胞百分比较实验14 d时升高，差异有统计学意义(t=2.68，P=0.02)。实验28 d，形觉剥夺组小鼠后部巩膜F4/80+巨噬细胞百分比和实验14 d时差异无统计学意义(t=1.86，P=0.09)，见表2。

组别nF4/80+巨噬细胞/%实验14 d实验28 dF4/80+/CD206+巨噬细胞/%实验14 d实验28 d形觉剥夺组60.91±0.311.19±0.210.45±0.330.87±0.19#自身对照组60.48±0.10∗0.85±0.23∗0.12±0.06∗0.50±0.27∗正常对照组60.45±0.21∗0.79±0.23∗0.21±0.160.51±0.28∗F值8.245.793.904.23P值0.0040.010.040.03

注：与相应时间点的形觉剥夺组比较，*P<0.05 (单因素方差分析，LSD检验)；与形觉剥夺组实验14 d比较，#P<0.05 (独立样本t检验)

2.3 形觉剥夺组小鼠后部巩膜组织中F4/80+、F4/80+/CD206+巨噬细胞百分比和屈光度、眼轴的相关性实验28 d，形觉剥夺组后部巩膜F4/80+/CD206+巨噬细胞百分比和屈光度呈显著负相关(r=-0.89，P=0.02；图1)，和眼轴呈显著正相关(r=0.98，P=0.001；图2)。实验28 d，形觉剥夺组后部巩膜F4/80+巨噬细胞百分比和屈光度及眼轴均无显著相关性(均为P>0.05)。

图1 实验28 d，形觉剥夺组后部巩膜F4/80+/CD206+巨噬细胞百分比和屈光度的相关性

图2 实验28 d，形觉剥夺组后部巩膜F4/80+/CD206+巨噬细胞百分比和眼轴的相关性

3 讨论

本研究探讨了近视发生发展过程中是否存在后部巩膜巨噬细胞的参与，结果表明，C57BL/6小鼠形觉剥夺性近视的形成伴随后部巩膜F4/80+/CD206+巨噬细胞的增加和动态变化，F4/80+/CD206+巨噬细胞的数量和屈光度存在显著负相关，同时和眼轴呈显著正相关，提示F4/80+/CD206+巨噬细胞参与C57BL/6小鼠形觉剥夺性近视的发生和发展过程。

大量研究显示，后部巩膜起到对眼球形状和大小的塑形作用，在此过程中，以基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)过度活化为代表的基质金属蛋白酶系统功能失衡起到重要的促进作用，上调MMP-2导致胶原纤维降解是近视发生发展过程中后部巩膜重塑和眼轴延长的关键环节[10-11]。有研究表明，巨噬细胞具有调控MMP-2的功能，从而影响疾病的进程[12-13]。因此，后部巩膜巨噬细胞的功能将对近视形成具有潜在影响，对此目前国内外相关研究尚少。

最常见的分类将巨噬细胞分为经典活化型(M1)和替代活化型(M2)，不同种类的巨噬细胞在体内复杂的微环境中发挥不同的功能[14]，其中M1型巨噬细胞具备很强的抗原提呈能力，发挥促进炎症和自身免疫的作用；而M2型巨噬细胞则起到抑制炎症的作用[15-16]，此外，研究表明，M2型巨噬细胞通过上调MMP-2的表达，从而促进胶原降解[17]。目前的研究认为，F4/80是巨噬细胞的经典通用标志物，既识别M1型又识别M2型巨噬细胞，被广泛用于标记总巨噬细胞[18]。由于M2型巨噬细胞表达CD206，即甘露糖受体[19]，因此，CD206被认为是高度可信的M2型巨噬细胞的常用标志物，F4/80+/CD206+则可代表M2型巨噬细胞[20]。

本研究结果显示，形觉剥夺28 d导致小鼠近视形成，同时伴随形觉剥夺组后部巩膜F4/80+/CD206+巨噬细胞的表达升高，这一趋势在小鼠形觉剥夺性近视形成之前(实验14 d)已经存在。因此，小鼠后部巩膜M2型巨噬细胞的增加和动态变化早于近视形成。此外，实验28 d形觉剥夺组后部巩膜F4/80+/CD206+巨噬细胞百分比和屈光度呈显著负相关性，和眼轴呈显著正相关性，进一步提示M2型巨噬细胞增加对近视发生的促进作用。

如前所述，F4/80+代表总巨噬细胞，本研究发现，实验14 d和28 d形觉剥夺组后部巩膜F4/80+巨噬细胞百分比均高于自身对照组和正常对照组，然而，未发现实验28 d形觉剥夺组后部巩膜F4/80+巨噬细胞百分比和屈光度及眼轴的相关性，因此提示，在巨噬细胞参与的小鼠形觉剥夺性近视的发生发展中，M2型巨噬细胞极化类型，而非总巨噬细胞，可能是促进近视形成的关键因素。

虽然本研究初步证实了巨噬细胞，主要是M2型巨噬细胞参与C57BL/6小鼠形觉剥夺性近视形成的假设，然而，本研究存在以下不足：首先，由于小鼠后部巩膜巨噬细胞数量较少，虽然经过多次预实验和方法改良，细胞活性的保持仍有待进一步完善，同时本研究例数不足，给数据分析造成一定偏差，可能是本研究未发现实验14 d形觉剥夺组和正常对照组F4/80+/CD206+巨噬细胞百分比差异有统计学意义的原因之一；其次，本研究单纯探讨了巨噬细胞的动态变化，尚未包含MMP-2等近视相关蛋白及生长因子，如碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子-β等的检测以及和巨噬细胞变化的相关性研究。因此，M2型巨噬细胞和近视发生发展的因果关系及作用机制尚需进一步研究加以证实，从而为近视的防控提供新的思路和治疗靶点。