微小RNA125b-5p在氧化应激损伤中的作用实验研究*

何梅俊，陈霜霜，任晶红，贾 佳

苏州大学药学院(苏州 215123)

氧化应激损伤由活性氧(Reactiveoxygenspecies，ROS)造成。ROS包括过氧化氢(H2O2)、羟自由基(OH-)和超氧阴离子(O2-)等。体内氧自由基代谢失衡导致ROS蓄积，攻击机体，导致机体组织脂质过氧化水平升高，引起DNA氧化损伤和蛋白质的表达异常[1-2]。氧化应激是脑卒中的主要病理机制[3]。缺血性卒中的发生是由于血栓阻断了血液对脑的供应,而血流恢复后导致的再灌注损伤与自由基的产生过多或体内抗氧化系统失衡相关。研究表明，再灌注过程中大量产生ROS：在缺血阶段，O2和葡萄糖的缺少导致谷氨酸转运蛋白的反向转运，导致谷氨酸的释放和谷氨酸兴奋性毒性[4]；缺氧则导致脑内酸中毒[5]。在缺血再灌注期间ROS大量生产，NO也过量生成，它与O2-反应生成活性更强的过氧亚硝基阴离子(ONOO-)，使缺血再灌注的氧化应激损伤增强。同时，超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶的功能障碍可能损害内源性抗氧化防御机制，进一步加剧氧化应激和缺血再灌注损伤[6-7]。受损组织进一步受到炎症反应的损伤或被免疫细胞浸润从而导致死亡[8]。目前对氧化应激损伤的调控机制还缺乏深入了解。

microRNA是一类高度保守的非编码、单链、小RNA(≈22 nt)。动物细胞内，miRNA与靶基因mRNA分子的3’端非编码区(3’-untranslated region，3’-UTR)互补配对后，通过降解与其互补配对的mRNA或抑制其翻译从而参与靶基因表达的调控。miRNA在生长、发育、凋亡以及人类疾病方面起着重要作用[9-11]。有文献报道，miR-125b在心肌中的表达增加显著降低了心肌梗塞面积，并阻止了缺血再灌注(I / R)诱发的心脏功能障碍。这些机制涉及抑制I / R诱导的NF-κB活化和预防心肌中I / R活化的p53介导的凋亡信号传导[12]。但是，目前尚不清楚miR-125b是否对氧化应激损伤具有调控作用。

血红素加氧酶-1(Hemeoxygenase-1, HO-1)也称为32-热休克蛋白(Hsp32)。氧化应激和其他有害刺激在脑或其他组织中可迅速诱导HO-1的表达[13]。研究表明，HO-1在多种氧化损伤模型中具有保护作用，有一定抗氧化作用。锰超氧化物歧化酶(Mn SOD)是中枢神经系统线粒体中重要的抗氧化物酶，主要作用是清除活性氧自由基，延缓衰老和对抗癌症。已有实验结果表明脑损伤和脑缺血组织中Mn SOD能够过量表达，清除细胞内过量的自由基，具有重要的神经保护作用。本文通过建立体外神经元氧化应激模型，在该模型中观察过氧化氢刺激后miR-125b表达水平变化，并探讨miR-125b是否能够上调HO-1和Mn SOD的表达、以及是否对氧化应激损伤具有保护作用。

材料与方法

1 材 料 DEME培养基(Hyclone公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；青霉素/链霉素(Hyclone公司)；H2O2(美国 Sigma 公司)；MTT(碧云天生物科技有限公司)；RNAiso Plus，cDNA逆转录试剂盒及SYBR Green(宝生物工程有限公司)；MiR 125b-5p类似物和对照类似物(广州锐博生物科技有限公司)。HT22细胞来自本实验室。

2 实验方法

2.1 细胞培养及传代：将HT22细胞复苏后，于含有10%胎牛血清以及1%青霉素/链霉素的DMEM培养基培养。之后将细胞放置于温度为37℃以及CO2含量为5%的恒温培养箱中培养。24 h后观察细胞状态，选择状态良好且处于对数生长期细胞进行传代培养，细胞面积占据培养皿80%时可用于下一步的实验。

2.2 细胞转染：使用Lipofectamine 2000转染NC mimic和miR125b-5p mimic。以24孔为例，稀释Lipofectamine 2000，将2 μl Lipofectamine 2000和50 μl Opti-MEM混匀，静置5 min。稀释miRNA类似物，取2 μl miR125b-5p NC/mimic和50 μl Opti-MEM，轻轻混匀后静置，将两种混合物混匀后加入细胞板相应孔中。24 h后采用RT-qPCR方法检测转染效率，进行后续试验。

2.3 MTT法测细胞活力：将状态良好的HT22神经元细胞以2×104/孔的密度接种于96孔板中，置于37℃恒温培养箱中培养。miR125b-5p mimic和NC转染细胞24 h后，造氧化应激模型，24 h后弃培养基，加入10 μl MTT溶液(5mg/ml)，于37℃恒温培养箱中反应4 h后弃去孔内液体，再加入100 μl的DMSO用以充分溶解结晶，置于脱色摇床上低速震荡。在全自动酶标仪中检测570 nm条件下的吸光度，以此定量反映细胞的活性。

2.4 实时荧光定量PCR(qPCR)：收集HT22细胞，弃培养基，用预冷PBS洗涤3次，加入1ml RNAiso Plus，冰上裂解5 min，收集液体，参照Takara公司RNAiso Plus试剂盒说明书提取细胞中的总RNA。检测RNA的浓度，取1 μg RNA用于逆转录，根据Takara公司RT-PCR 反应试剂盒说明书配置混合物，逆转录合成cDNA。稀释cDNA，将1.5 μl cDNA与8.5 μl的引物、DEPC水和SYBR Green混合液混匀，每组设置3个复孔，封膜后上机，在ABI Step One Plus PCR 仪上进行实时荧光定量PCR检测。反应条件：95℃ 3 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s(循环40次)。以GAPDH为内参，引物序列见表1。

表1 引物序列表

结 果

1 miR125b-5p在H2O2刺激HT22细胞中表达下调 采用体外培养HT22海马神经元细胞，造过氧化氢诱导神经元氧化应激模型，研究miR125b-5p在氧化应激损伤中的作用。首先用H2O2(800 μmol/L)刺激HT22细胞24 h后，提取miRNA，采用RT-qPCR的方法检测miR125b-5p的表达变化。结果表明，H2O2刺激HT22细胞24h后，与正常对照组相比，miR125b-5p的表达水平明显下降(图1)。

图1 miR125b-5p在H2O2刺激HT22神经元细胞中的表达

2 过表达miR125b-5p显著提高H2O2诱导的HT22细胞存活率 图1实验结果表明氧化应激可显著下调miR125b-5p表达，而后我们利用HT22神经元细胞来研究miR125b-5p对H2O2诱导神经元氧化损伤的保护作用。利用脂质体分别将miR 125-5p的类似物(miR125b-5p mimics)转染入细胞实现其过表达，24h后，收集细胞，通过RT-qPCR方法检测其过表达效率。如图2A所示，和阴性对照类似物(NC mimics)相比，miR125b-5p mimics组中miR125b-5p表达水平显著升高。转染24h后，利用H2O2处理HT22细胞24h，模拟体外氧化应激模型，随后采用MTT法检测细胞活力。如图2B所示，相对于正常对照组，H2O2刺激过后细胞活力明显下降，而相对于阴性对照组，过表达miR125b-5p组的细胞存活率明显上升。

3 过表达miR 125b-5p增加H2O2诱导神经元中抗氧化酶的表达 氧化应激损伤会诱导抗氧化酶的表达，为了探究miR125b-5p对神经元的氧化应激保护作用的机制是否和调控抗氧化酶表达有关，我们利用q-qPCR技术，检测氧化应激损伤后细胞内HO-1和Mn SODmRNA的表达水平。结果如图3所示，相对于正常对照组，H2O2刺激后HT22神经元细胞中HO-1、Mn SOD的mRNA表达水平略有升高，而相对于阴性对照组(NC mimic)，过表达miR125b-5p组(miR125b-5p mimics)上调H2O2诱导HT22神经元细胞中HO-1、Mn SOD的mRNA表达水平。

图2 过表达效率及MTT细胞活力测定结果(与NC组比较，*P<0.05，**P<0.01)

图3 过表达miR125b-5p上调H2O2诱导HT22细胞中抗氧化因子的表达

讨 论

据统计全球每年因脑卒中丧命将近有550万人，4400万人因中风致残，到2020年人数达6100万[14]。我国每年发病约200万人，死亡约150万人，存活的患者中，约四分之三不同程度丧失劳动能力，重度致残者占40%。脑卒中以缺血性卒中为主，可将其细分为血栓性卒中或脑栓塞。目前只有美国FDA批准通过静脉注射组织纤溶酶原激活物用来治疗急性缺血性卒中，在卒中发生的4.5h内这种激活物可以溶解血栓或者重通，但由于治疗窗较短，仅有很少一部分病人(<5%)能接受这种治疗[15]。因此，急需开发新的脑缺血治疗药物并应用于临床。

在脑缺血后神经元损伤中氧化应激损伤起到了至关重要的作用，大量自由基可诱导脂质、蛋白质及核酸的过氧化对细胞造成直接损伤，还可以通过DNA损伤、线粒体途径及转录因子等途径导致细胞凋亡[16]。由此引发一系列效应加重脑损伤。因此，氧化应激损伤是造成脑缺血再灌注损伤的重要原因。但目前对于氧化应激损伤的调控机制还缺乏深入研究。

microRNA是一类高度保守的非编码小RNA(≈22 nt)，在转录后水平对基因表达进行调控。miRNA与靶基因mRNA分子的3’端非编码区(3’-untranslated region，3’-UTR)互补配对后，通过降解与其互补配对的mRNA或抑制翻译从而参与靶基因表达的调控。miRNA的编码基因在细胞核内先由RNA聚合酶Ⅱ产生较长的初级转录产物pri-miRNA，中间有一段不完美配对的茎-环结构，而后通过RNaseⅢ核酸内切酶Drosha酶和双链RNA结合蛋白Pasha蛋白或DiGeorge关键区域8(RNA binding protein DiGeorge critical region-8，DGCR8)的作用分裂释放miRNA前体(precursor miRNA，pre-miRNA)。miRNA前体长度为60～70nt且带有茎环结构，它由Ran-GTP依赖的输出蛋白-5(Exportin-5)运出细胞核进入胞质基质中。胞质基质中的RNaseⅢ(即Dicer酶)识别pre-miRNA的双链，将其剪切成成熟的双链miRNA。而后解链为两条单链，一条被降解，一条结合RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)。而后，microRNA通过两种机制发挥功能：首先是装载成RISC后使互补配对的mRNA降解；其次，miRNA可抑制mRNA的翻译，降低靶基因的蛋白水平但不影响其mRNA水平。

已被报道的人源miRNA有1527种以及鼠源miRNA有741种[17]，而已建立的数据库可用于搜索miRNA序列及其靶基因[18]。有研究表明，miR-145、miR-124等miRNA都可能与脑缺血的发病有一定关系，其中抑制miR-145可显著上调SOD-2的表达，而miR-124a则有可能成为脑缺血的一个治疗靶点[19-20]。已有的研究发现有多种miRNA在脑缺血再灌注损伤中有表达变化差异，在神经元的存活、发育、分化等方面发挥着重要作用。microRNA lin-4是第一个被发现的miRNA，是调控线虫胚胎后期发育的重要基因[21]。microRNA-125b(miR-125b)是lin-4的同系物。目前已有研究表明miR-125在心肌缺血再灌注损伤中起到保护作用，但具体机制仍需进一步研究。因此，本实验将探讨miR-125b-5p对神经元氧化应激损伤是否具有保护作用。

在本实验中，首先我们采用H2O2刺激HT22海马神经元细胞构建氧化应激模型，H2O2处理后，提取miRNA，采用q-PCR方法检测miR125b-5p的表达变化，结果发现氧化应激损伤后miR125b-5p的表达明显下降。为进一步研究miR125b-5p对H2O2诱导神经元是否具有保护作用，我们将miR125b-5p的类似物(miR125b-5p mimics)及其阴性对照(NC)转染到细胞中，实现miR125b-5p过表达，随后造氧化应激模型，采用MTT法检测细胞活力，结果显示miR125b-5p过表达明显提高H2O2刺激后神经元细胞存活率。这些结果提示miR125b-5p对神经元氧化应激损伤具有一定保护作用。

HO-1、Mn SOD与清除自由基，保护氧化应激导致的细胞、组织损伤有一定的关系。目前普遍认为HO-1的mRNA和蛋白质表达水平在细胞和组织中上调，可以保护由氧化应激引起的细胞、组织损伤。有研究表明，大鼠肝硬变模型中HO-1可以通过抗氧化应激作用保护肝缺血再灌注损伤[21]。Mn SOD是中枢神经系统线粒体中重要的抗氧化物酶，主要作用是清除活性氧自由基，抗癌症和延缓衰老。已有实验结果表明脑损伤和脑缺血组织中Mn SOD能够过量表达，清除细胞内过量的自由基，具有重要的神经保护作用。为了探究miR125b-5p在过氧化氢刺激神经元细胞后对抗氧化酶HO-1和Mn SOD的表达水平的影响，我们将miR125b-5p的类似物(miR125b-5p mimics)或对照(NC mimics)转染到细胞中，用H2O2刺激，采用RT-qPCR技术，检测HO-1和Mn SOD的mRNA表达，结果发现：与NC组相比，过表达miR125b-5p组细胞抗氧化酶HO-1、Mn SOD的mRNA表达水平显著升高。

综上所述，我们的研究发现miR125b-5p在体外神经元细胞模型中对氧化应激损伤有一定的保护作用，其作用机制可能与上调控抗氧化酶如HO-1、Mn SOD的表达水平有关。下一步我们将深入研究miR125b-5p在脑缺血氧化应激损伤中的作用及具体作用机制，为研发治疗脑缺血的新型药物提供一定理论依据。