HPLC方法同时测定疏肝止痛片中三种有效成分含量

吕 玥，汤 湧，李立言，阎 姝

为保证复方制剂的安全性与有效性,中药复方制剂质量控制的方法与手段已成为中药现代化的最重要研究课题之一。疏肝止痛片是天津市南开医院研制的具有良好临床疗效的一种中药制剂[1]，功效为疏肝理气，行气止痛。临床上主要用于早期胆系感染及胆石病引起的胆绞痛、急性胆囊胰腺炎、胆道术后综合征等。其处方由《景岳全书·古方八阵·散阵》中的柴胡疏肝散[2]加减化裁而来，全方由白芍、陈皮、柴胡、甘草、延胡索等6味药材组成。方中以柴胡功善疏肝解郁，为君药；延胡索活血行气以止痛，助柴胡以解肝经之郁滞，并增行气活血止痛之效，为臣药；陈皮理气行滞，白芍、甘草养血柔肝，缓急止痛，均为佐药；甘草调和诸药，为使药。诸药相合，共奏疏肝行气、活血止痛之功。

笔者查阅文献发现疏肝止痛片质量检测多为单一指标成分，而该药品属于复方制剂，仅通过单一的指标成分不能反映出整体制剂的质量情况，又因该制剂中部分药材的指标成分难于检测，故笔者在本实验选择该制剂处方中的君药-柴胡所特有的一种成分即柴胡皂苷B2作为指标成分，以及选择药材的特有成分即芍药苷、橙皮苷作为指标成分，设计实验条件以达到同时测定到三种指标成分，以更加全面地反映制剂的质量情况。在检测方法的选择上，因考虑到医院制剂室检验设备的实际情况，以及设备和人员方面受到限制，因此对于疏肝止痛片的含量测定仍然倾向于使用高效液相色谱（HPLC）方法分析，并通过多波长检测以及优化提取方法和液相梯度洗脱条件，达到可以同时测定疏肝止痛片中多个主要指标成分含量的要求。该方法除了可以实现定量测定疏肝止痛片中化学成分含量的目的外，也可以通过对疏肝止痛片白芍、陈皮、柴胡三种药材的指标成分含量测定，而进一步反映疏肝止痛片的质量情况，保证临床用药的安全性、有效性和药物质量的一致性。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂试药 Agilent 1100 高效液相色谱仪；KQ-700GDV超声波清洗器(昆山市超声仪有限公司)； BP211D十万分之一电子天平（德国赛多利斯）；旋转蒸发仪（天津市泰斯特仪器有限公司）；D-37520离心机（德国赛默飞世尔）。芍药苷对照品：批号23180-57-6，纯度98.0%；柴胡皂苷B2对照品：批号58316-41-9，纯度98.0%；橙皮苷对照品：批号38028-32-8，纯度98.0%。均由南京森贝伽生物科技有限公司提供。疏肝止痛片样品（批号20190109、20190315、20190325）由天津市南开医院制剂室提供。水为纯净水，乙腈为色谱纯（霍尼韦尔贸易有限公司），其余实验使用试剂均为分析纯。

1.2 溶液的制备

1.2.1 混合对照品储备液 分别精密称取芍药苷对照品、橙皮苷对照品及柴胡皂苷B2对照品适量，加入80%的甲醇溶液，配制芍药苷、橙皮苷和柴胡皂苷B2的对照品储备液。精密量取对照品储备液20 mL，置于25 mL容量瓶中，加80%的甲醇，摇匀，即得每1 mL分别含9.56 μg芍药苷、5.02 μg柴胡皂苷B2、9.49 μg橙皮苷的混合对照品储备液。

1.2.2 供试品溶液 取疏肝止痛片20片，研细，过100目筛，取约0.6 g，精密称定，置于锥形瓶中，加80%乙醇溶液30 mL，50 ℃下超声提取45 min（700W，40kHZ），放冷，5000 r/min离心10 min。取上清液，残渣用80%乙醇洗涤，混合滤液，置于50 mL容量瓶中，加80%乙醇定容，即得供试品溶液。

1.2.3 阴性对照溶液 根据疏肝止痛片处方和制备工艺，分别制备不含白芍、陈皮、柴胡药材的阴性对照品，按照“1.2.2”项下方法分别制备成相应阴性对照溶液。

2 结果

2.1 色谱条件 色谱柱：KromasiL C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为0.3%磷酸溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脱次序见表1；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；柱温：38℃；检测波长：230 nm（芍药苷），254 nm（柴胡皂苷B2），283 nm（橙皮苷）。

表1 梯度洗脱次序

2.2 专属性试验 精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液及不含白芍、陈皮、柴胡的阴性对照品溶液各10 μL，在“2.1”色谱条件下分别注入色谱仪进行分析，得到相应色谱图，如图1、2、3所示。在该色谱条件下，芍药苷、柴胡皂苷B2、橙皮苷均达到良好分离，且各组分之间相不干扰。

图1 对照品溶液色谱图

图2 供试品溶液色谱图

图3 阴性对照溶液色谱图

2.3 线性关系考察 分别精密量取混合对照品储 备 液2 mL、2.5 mL、5 mL、10 mL、15 mL、20 mL置于25 mL容量瓶中，加80%甲醇稀释至刻度制成混合对照品稀释液。按照“2.1”项的色谱条件对稀释后的各混合对照品溶液及稀释前对照品储备液（共7个标准品浓度）进行测定，并以质量浓度X (mg/mL) 为横坐标，峰面积Y 为纵坐标，绘制出标准曲线，拟合回归方程、线性范围及相关系数见表2。

表2 回归方程、相关系数及线性范围

2.4 精密度实验 精密吸取对照品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进行测定，连续进样6次。记录芍药苷、柴胡皂苷B2、橙皮苷的峰面积，计算得相对标准偏差（RSD）分别为：1.8%，1.6%，0.5%。结果表明，方法精密度良好。结果见表3。

表3 精密度实验（n=6）

2.5 重复性实验 取约0.6 g的同一批号的疏肝止痛片样品6份，精密称定，按照“1.2.2”项下方法平行制备供试品溶液6份，在“2.1”项下色谱条件进行测定，测得芍药苷、柴胡皂苷B2、橙皮苷含量的RSD值分别为0.20%，0.89%，0.21%。结果表明，此方法的重复性良好。结果见表4。

表4 重复性试验（n=6）

2.6 稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别于配制后0、3、6、10、16、24 h，按照“2.1”项下色谱条件进行测定，测得芍药苷、柴胡皂苷B2、橙皮苷含量的RSD值分别为0.25%、0.94%、1.33%。结果表明，供试品溶液在24 h内稳定。结果见表5。

表5 稳定性试验（n=6）

2.7 加样回收率试验 取同一批号含量相同的疏肝止痛片样品6份，每份约0.6g，精密称定，按“1.2.2”项下方法制备成供试品储备液。精密量取供试品储备液5 mL，分别加入适量的对照品储备液，定容至10 mL。按照“2.1”项下色谱条件进行测定，记录各成分的峰面积，计算回收率。结果芍药苷、柴胡皂苷B2、橙皮苷的平均回收率（n=6）分别为99.3%、98.6%、100.5%；RSD值分别为0.64%、1.04%、0.54%。结果见表6。

2.8 样品含量测定 取3个批号的疏肝止痛片样品（每片0.3 g），按照“1.2.2”项下条件分别制备成供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进行测定。结果见表7。

3 讨论

本实验中所用到的疏肝止痛片样品处方由6种药材构成，与《中华人民共和国药典》2015版一部中所收录的舒肝丸近乎相同，主要是在保留原方中4味药材的同时，加入甘草及柴胡。根据所记载“舒肝丸”的含量测定方法，只检测了其中的芍药苷成分的含量，而单一的芍药苷含量并不能反映产品的质量情况。近几年，对于上述的6味药材，金林等[3]测定了白芍中芍药苷等几种成分的含量，并将其作为指标成分对白芍进行了质量评价；闵宇航等[4]、李军等[5]对柴胡中的皂苷类成分进行测定分析；仇雪[6]对陈皮进行了研究分析，得到橙皮苷为其主要指标成分。依据以上文献，本实验同时选定白芍、柴胡、陈皮3味药材的指标成分为含量测定对象，即选取疏肝止痛片三种药材的三种有效成分进行测定。

表6 样品加样回收率试验（n=6）

表7 含量测定结果（mg/片）

对于中药复方制剂含量测定成分提取最常用的方法是超声提取法和加热回流提取法。疏肝止痛片的待测成分中芍药苷受热不稳定、易水解，不宜长时间回流[7]；根据所查文献，柴胡皂苷不宜使用加热回流法[8]；提取橙皮苷使用超声提取法优于加热回流法[9-10]。在本实验过程中，对比了80%、60%、40%、20%乙醇的提取效果和超声提取的时间分别为30 min、45 min的提取效果，最终发现在80%乙醇为提取剂超声提取45 min可以充分提取三种有效成分。

实验的流动相为0.3%磷酸溶液（A）-乙腈（B）。在进行实验的过程中对流动相进行了筛选，考察了0.3%磷酸溶液（A）-乙腈（B）-甲醇（C）、0.5%磷酸溶液（A）-乙腈（B）及0.3%磷酸溶液（A）-乙腈（B）的可行性，结果表明前两种流动相的选择并不能很好的分离各有效成分，相较而言，最后一种流动相的选择可以较为清晰的分离出各有效成分，没有出现拖尾现象，且所出峰的峰形较好。

本实验在保证各组分有良好的分离度的同时尽可能缩短实验所用的时间，采用了梯度洗脱法[11-12]，即通过改变有机相的比例从而将分析过程分为出峰区和过渡区，在出峰时采取小梯度以提高分离度，在其过度时则采取大梯度以减小分析时间。由于实验的分析时间长，为了改善峰的拖尾情况，将柱温由原来的30℃提高到38℃。通过观察实验的图谱，发现采用梯度洗脱且柱温为38℃、流速为1.0 mL/min时峰形较好且无拖尾。

依据《中华人民共和国药典》2015版一部[13]药材和饮片的规定，白芍药材以乙腈-0. 1%磷酸溶液（14:86)为流动相，检测波长为230 mm，理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000；陈皮药材以甲醇-醋酸-水（35:4:61)为流动相；检测波长为283 nm，理论板数按橙皮苷峰计算应不低于2000；柴胡药材以乙腈为流动相A，以水为流动相B，检测波长为210 nm，理论板数按柴胡皂苷a峰计算应不低于10000。综上，选择230 nm、254 nm、283 nm为三种有效成分的检测波长。

本实验建立的同时测定疏肝止痛片中3种有效成分的HPLC方法专属性好、回收率高、精密度及重复性良好，结果均符合《中华人民共和国药典》2015年版中质量分析方法验证指导原则（四部9101）的要求。因此，该法可用于对“疏肝止痛片”的含量测定及质量控制。