芫荽遗传多样性与性状的关联分析

李小梅 张景涛

摘要：为掌握引进芫荽种质资源遗传情况，选用23条引物对96份芫荽资源进行分析，在此基础上分析其遗传多样性与性状之间的关联。结果表明，供试群体的Simpson指数为0.098～0.505，Shannon指数为0.085～0.301，种质特异指数为69.964～208.694。53个RAPD标记中有17个标记与15个性状相关联。与抽薹天数（DSE）、始花期（DSF）、终花期（DEF）、收获天数（DH）、最长基生叶长（LLBL）、花期（FR）、茎中花青素（ANST）、株高（PH）、基生叶数（NBL）、植株有叶状态（LP）、基生叶生长习性（HBL）、分枝数（NB）、果实形状（SF）、千粒重（W1000F）和果实裂果趋势（TSF）关联的多态性位点分别有1、2、2、2、2、3、2、2、2、2、4、2、6、2和2个。其中，4个位点同时与两个或2个以上性状相关联。

关键词：芫荽;RAPD标记;遗传多样性;关联分析

中图分类号：S573+.2          文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）21-0107-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.21.022

Abstract： In order to understand the genetic information of the introduced Coriander germplasm resources， 23 random primers were selected for the polymorphism detection of 96 materials， and the relationship between genetic diversity and traits was analyzed. The results showed that the Simpson's index of the population was 0.098～0.505， and the shannon's index was 0.085～0.301， and the specialty index was 69.964～208.694. 17 of the 53 RAPD markers were associated with 15 traits. The numbers of polymorphic markers associated with days with convulsions （DSE）， initial flowering stage （DSF）， flowering stage （DEF）， days of harvest （DH）， longest basal leaf length （LLBL）， flowering stage （FR）， anthocyanins （ANST）， strain High （PH）， basal leaf number （NBL）， plant leafy state （LP）， basal leaf growth habit （HBL）， number of branches （NB）， fruit shape （SF）， 1000-grain weight （W1000F） and fruit cracking Trend （TSF） were 1，2，2，2，2，3，2，2，2，2，4，2，6，2 and 2. Among them， 4 sites are associated with two or more traits at the same time.

Key words： Coriandrum sativum; RAPD makers; genetic diversity; association analysis

芫荽（Coriandrum sativum L.）是世界常用的香料[1]，又名香菜、鹽荽、胡荽，是伞形科草本植物，常作绿叶蔬菜，茎叶有特殊芳香味。由于其生育期短，可四季栽培，以春秋两季栽培品质为好。芫荽具有药用价值，根茎叶及种子均可入药，在中东地区特别是伊朗，芫荽用于预防抽搐、失眠、焦虑等症;在欧洲，其被作为一种治疗糖尿病的药，种子可用于助消化、辅助治疗风湿病[2-10]。研究表明，芫荽具有抑菌、抗氧化、抗炎及抗糖尿病功效[11]，对缓解某些食物中毒也有一定的作用[12]。

种质资源是遗传研究和品种改良的基础[13]，通过对种质资源进行遗传多样性分析，可以指导育种，提高育种效率。在分析遗传多样性基础上，挖掘有利基因，对于后期分子标记辅助选择具有重要意义。关联分析是以连锁不平衡原理为基础，鉴定群体内目标性状与遗传标记或候选基因关系的分析方法，已成为基因发掘研究的主要方法。关联分析无需花费较多时间和精力去构建作图群体，能够有效分析等位基因对性状的贡献率[14-16]。已报道芫荽相关研究主要集中在种植、成分分离和功能验证方面，相关功能因子及作用机制的研究多集中于成分分析，在分子水平上有关芫荽的研究鲜见报道。L？仵pez等[17]对芫荽表型、生化及分子多样性进行了评价，李小梅等[18]对芫荽进行了遗传多样性的RAPD分析。RAPD标记应用于芫荽农艺性状关联分析的研究鲜见报道。本研究以96份芫荽种质资源为材料，对19个性状进行测定与分析[19]，基于自然群体的连锁不平衡作图策略，进行RAPD分子标记与其农艺性状关联分析，旨在为后期芫荽新品种选育及分子标记辅助选择提供理论依据。

1  材料与方法

1.1   供试材料及生物学性状测定

供试96份芫荽种质材料为国外资源库引进，具体见表1。

所有材料连续两个生长季种植于哈尔滨市农业科学院实验基地，随机区组设计，3次重复。对生物学性状进行调查与测定[19]，两个生长季各测1次，测定及赋值标准[20]见表2。需要计数的采用重复计数取平均值。

1.2   RAPD標记分析

采用改良CTAB法提取DNA。使用Eppendorf 公司PCR仪进行扩增，反应体系（20 μL）为1.0 ng/μL 模板DNA、0.45 mmol/L dNTP、1.3 μmol/L随机引物、0.6 U Taq酶、2.0 mmol/L Mg2+。94 ℃预变性4 min，40个循环（94 ℃变性30 s，39 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s）;72 ℃延伸10 min，4 ℃终止反应。产物1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色拍照。从300条随机引物中筛选出多态性高的引物做3次重复。

1.3  数据处理

使用Genetics Statistics 3.0（2007SR11872）计算引物的Simpson多样性指数和Shannon多样性指数，分析种质特异性指数。

群体结构分析：使用Structure软件对96份芫荽种质的群体结构进行基于数学模型的类群划分，并计算材料相应的Q。Q为该品种基因型变异来源于某亚群的概率。

关联分析：利用TASSEL软件（Edward Buckler，2007）的GLM（General linear model）程序，将各个体Q作为协变量，将19个性状的表型数据分别对标记变异进行回归分析。

2  结果与分析

2.1  RAPD标记扫描分析

300条引物对具有代表性的48份芫荽资源进行PCR扩增，经过复筛，得到23条扩增性强、清晰度高、稳定性好的引物，用此23条引物对96份芫荽种质进行RAPD扩增，共扩增53条带，其中34条为多态性条带，多态性比例为64.2%。每个引物检测到的等位基因个数分布在2～10，平均为4.61，引物检测的等位基因数越多，引物在资源鉴别中的作用就越大。芫荽基因组PCR扩增，不同引物在扩增总条带数、多态性条带数、条带亮度等方面均表现出差异。

利用遗传统计软件Genetics Statistics3.0分析引物的多样性指数（表3）。引物的Simpson多样性指数介于0.098～0.505，平均多样性指数为0.344，多样性指数大于平均指数的引物有14条;引物的Shannon多样性指数介于0.085～0.301，平均多样性指数为0.221，多样性指数大于平均指数的引物与Simpson多样性指数中一致。等位基因数与多样性指数这两类大于平均数的指数中，共同出现的引物有4对，说明在一定情况下，引物检测到的等位基因数越多，其多样性指数越高，表明区分品种的能力越强。

用资源遗传统计软件Genetics Statistics 3.0分析得到种质的特异性指数（表4），可以看出，种质特异指数介于69.964～208.694，平均为104.29。84号种质的特异指数最高，77号种质特异指数最低。其中，大于平均特异性指数的种质编号有5、6、9、11、13、14、15、17、18、19、21、22、24、30、32、33、36、37、38、

44、45、52、54、60、64、65、67、68、71、76、79、81、83、84、

86、89、92。种质特异指数越高，表示该种质在检测位点中含有特异等位基因数目越多，这可为种质资源鉴定提供参考。

2.2  群体结构分析

群体结构指一个群体内亚群存在的情况。亚群的混合使整个群体的LD强度增强，导致虚假基因的多态性位点与性状之间的相关性，从而提供假阳性结果。关联分析前对群体结构进行分析和调节是必要的。通过Structure软件对该群体结构进行基于数学模型的类群划分，计算材料相应的Q分析，先设定群体数目（K）为4～15，并假定位点都是独立的，进行10次随机抽样分析，以获得稳定可靠的结果，然后依据分析选取一个合适的K。经分析确定当K=14时得到最稳定、最可信的分类，即判断该资源群体可以分为14个亚群。

2.3  与性状相关联RAPD分析

群体结构是造成关联分析假阳性结果的主要原因，Buckler 等利用随机标记估算的各个个体相应的Q作为协变量，对性状的表型变异与标记变异进行回归分析，消除参试材料的群体结构引起的伪关联，从而找到与性状QTL真正相关联的标记及其等位变异。利用TASSEL软件的GLM（General Linear Model）程序，以各个体Q作为协变量进行群体矫正，将19个性状的表型数据分别对标记变异进行回归分析，以此寻找影响芫荽性状变异的主要变异位点（阈值选择P<0.05为显著，P<0.01为极显著）。结果见表5。

分析表明，53个RAPD标记中有17个标记与19个性状中的15个性状相关联。纵向分析表5发现，与抽薹天数（DSE）相关联的标记有1个（S31-750），该标记对此性状的解释率为0.042;与始花期（DSF）相关联的标记有2个（S31-1500、S31-750），2个标记对该性状的解释率均为0.050;与终花期（DEF）相关联的标记有2个（S31-1500、S31-750），2个标记对该性状的解释率均为0.050;与花期（FR）相关联的标记有3个（S183-2200、S183-1700、S2003-1500），对该性状的解释率分别为0.065、0.065、0.055;与收获天数（DH）相关联的标记有2个（S31-1500、S31-750），对该性状的解释率均为0.049;与茎中花青素（ANST）相关联的标记有2个（S507-1800、S507-1500），对该性状解释率均为0.064;与基生叶数（NBL）相关联的标记有2个（S167-1500、S167-1100），对该性状的解释率均为0.048;与最长基生叶长（LLBL）相关联的标记有2个（S31-1500、S31-750），对该性状的解释率均为0.056;与基生叶生长习性（HBL）相关联的标记有4个（S24-1800、S24-1600、S1260-1300、S2003

-1900），对该性状的解释率分别为0.084、0.084、0.074、0.074;与株高（PH）相关联的标记有2个（S507-1800、S507-1500），对该性状解释率均为0.067;與植株生叶状态（LP）相关联的标记有2个（S167-1500、S167-1100），对该性状的解释率均为0.069;与分枝数（NB）相关联的标记有2个（S1-2200、S1-700），对该性状的解释率均为0.053、;与果实形状（SF）相关联的标记有6个（S31-1500、S31-750、S1260-1300、S2003-1900、S2029-1000、S2029-700），对该性状的解释率分别为0.078、0.078、0.093、0.093、0.085、0.085;与千粒重（W1000F）相关联的标记有2个（S1260-1300、S2003-1900），对该性状的解释率均为0.104;与果实裂果趋势（TSF）相关联的标记有2个（S1260-1300、S2003-1900）对该性状的解释率均为0.096。

横向分析（表5）可以发现，同一标记与多个性状相关联的情况在分析中出现，如S31-1500标记与5个性状有关联（始花期、终花期、收获天数、最长基生叶长、果实形状）;S31-750标记与6个性状关联（抽薹天数、始花期、终花期、收获天数、最长基生叶长、果实形状）;S167-1500与S167-1100标记均与2个性状关联（基生叶数、植株生叶状态）;S507-1800与S507-1500标记均与（茎中花青素、株高）有关联;S1260-1300标记与4个性状关联（基生叶生长习性、果实形状、千粒重、果实裂果趋势）;S2003-1900标记同样与基生叶生长习性、果实形状、千粒重、果实裂果趋势4个性状关联。

其中，S167-1100与植株生叶状态（LP）的关联，S1260-1300、S2003-1900与果实裂果趋势（TSF）的关联，S1260-1300、S2003-1900与千粒重（W1000F）的关联，S1260-1300、S2003-1900、S2029-1000与果实形状（SF）的关联，S24-1800与基生叶生长习性（HBL）的关联是极显著水平的关联。

从表5还可看出，多数同一引物的两个标记位点与某一性状关联，其表型变异解释率相同，如S31-1500、S31-750标记与始花期相关联，解释率均为0.050;S507-1800、S507-1500与茎中花青素解释率均为0.064。

利用关联分析结果，可根据育种目标要求进行育种设计，将不同标记位点上的优良等位变异聚合于一体，改良单性状或综合性状。

3  小结与讨论

群体结构的不均一性影响多态性位点的连锁不平衡状态，进而影响关联分析的准确性。本研究通过多位点基因型数据的聚类来分析群体结构，计算每一芫荽种质归入各亚群的概率（Q），并以每一芫荽种质的Q作为协变量进行关联分析，矫正亚群混合造成的伪关联。在资料处理过程中，对不包括Q协变量与包括Q协变量的关联分析结果进行比较，发现增加Q协变量后检出的关联位点明显少于不包括Q协变量所检出的关联位点，且在关联位点的表型变异解释上二者也有明显的区别。由此可见，将Q作为协变量纳入计算，在一定程度上规避了亚群混合造成的伪关联。

种质资源是育种的基础，遗传基础狭窄是制约优良品种选育的主要因素之一。因此分析资源的遗传多样性，比较相互间亲缘关系的远近，对于育种工作的开展具有重要的指导意义。形态学分析与分子标记分析表明本研究收集的资源遗传多样性较好。

形态学与分子标记聚类结果均表现出分类与来源地不具有一定的相关性，说明资源间亲缘关系与来源地之间关系不密切，可能与种质的交换和广泛的遗传变异有关。形态学标记是对各植物学和生物学性状进行鉴定并分类，揭示的是芫荽的外部表现，而分子标记揭示的是芫荽碱基序列上的差异，从遗传物质上揭示芫荽的遗传多样性。关联分析也称关联作图，已应用到许多植物上，如拟南芥、小麦、玉米、大麦、大豆等[21]。本研究利用TASSEL软件对调查的表型性状和分子标记进行关联分析，分析发现19个性状中有15个性状与标记相关，与15个性状相关联的标记有17个。同时也发现，存在同一个性状与多个位点相关联，也存在同一标记与多个性状相关联。RAPD标记重复性差，试验标记数量有限，在连续两年的重复试验中得到的标记较少。本研究初步分析了芫荽群体基因组状况及其与性状的关联，在此基础上将作扩展与深入研究。

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