仙灵脾配伍雷公藤治疗类风湿关节炎大鼠的减毒增效研究

杜星海 邹小明 蔡田恬 阮 菲

1 浙江中医药大学附属第一医院 浙江 杭州 310006

2 浙江省杭州市中医院 浙江 杭州 310007

雷公藤为卫矛科雷公藤属植物雷公藤（TriPtergium wilf ordii Hook.F）的根，性苦味寒，有大毒，归心、肝经。具有祛风除湿、活血通络、消肿止痛、杀虫解毒之功效[1]，雷公藤及其制剂作为免疫抑制药物广泛运用于临床，其中生殖系统的损伤是常见的临床不良反应之一。仙灵脾为小檗科植物箭叶淫羊藿［EPimedium sagittatum（Sieb.et Zucc.）Maxim.］或淫羊藿（E.brevicornum Maxim.）的全草，具有补肾壮阳、祛风除湿、强筋健骨的功效[2]。临床上，仙灵脾可与雷公藤配伍来降低雷公藤的毒副作用。本文就仙灵脾配伍雷公藤的减毒增效作用进行实验研究，以探讨其作用原理和机制，现报告如下。

1 实验材料

1.1 实验动物：清洁级waster大鼠48只，雌性，体质量180～220g，上海西普尔-本凯试验动物有限公司提供，动物合格证号：SCXK(沪)2013-0016，饲养于浙江中医药大学动物实验中心屏障区，室温调节在21～25℃，空气流通，相对湿度50%左右。

1.2 药品与试剂：雷公藤、仙灵脾饮片购于浙江中医药大学中药饮片有限公司，经鉴定为合格饮片，Freund’s完全佐剂（Sigma公司，10mg/ml BCG）；氯化钠注射液（杭州民生药业有限公司，批号：20171108）；放免试剂盒卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、雌二醇（E2）（sigma公司）。

1.3 仪器：足趾容积测量仪（山东医学科学院设备站），AR80组织包埋机（MICROM），多功能酶标仪（Thermo Scientific公司）

2 实验方法

2.1 药液的制备：取10g雷公藤，先煎煮1小时，然后加入不同比例的仙灵脾混合煎煮1小时，滤过，滤渣加水再煎煮1小时，合并滤液，浓缩至20ml，每ml提取液含雷公藤0.5g。仙灵脾高剂量组每ml含仙灵脾1.5g，仙灵脾中剂量组每ml含仙灵脾0.75g，仙灵脾低剂量组每ml含仙灵脾0.5g。

2.2 佐剂性类风湿关节炎模型的制作：大鼠适应性喂养1周后，随机数字法分取8只作为正常组，右侧足垫皮内注射无菌生理盐水0.1ml，其余大鼠右侧足垫皮内注射完全弗氏佐剂0.1ml[3]。

2.3 分组与给药：按随机数字表将大鼠分为正常组、模型组、仙灵脾高剂量组、仙灵脾中剂量组、仙灵脾低剂量组和雷公藤组，每组各8只。于造模当天按1.2ml/100g大鼠体质量分组口服灌胃给药，每天1次，正常组和模型组灌服等体积生理盐水，连续给药21天。

2.4 观察指标与方法：各组大鼠每4天称质量一次，并用足跖容积测量仪测患侧足跖容积，计算各组动物足跖肿胀率；末次给药后禁食不禁水12h以上，大鼠腹主动脉取血，静置后离心（3000r，10min）分离血清，ELESA法测血清中性激素E2、FSH、LH的值。解剖取出每只大鼠的脾脏、胸腺、子宫和卵巢，用滤纸吸去脏器表面的血液，用电子天平精密称质量，计算大鼠肝脏、脾脏和胸腺的脏器指数。计算公式为：大鼠脏器指数=脏器质量（mg）/体质量（g）。将大鼠子宫和踝关节用10%中性甲醛固定后行HE染色，观察病理改变。

2.5 数据统计：使用SPSS 17.0统计软件，模型组与空白组进行两两配对的t检验；模型组与各给药组进行方差分析，若方差齐性则采用LSD检验，若方差不齐则采用Dunnet’s法检验。

3 实验结果

3.1 大鼠体质量增长率（末次测量体质量）：仙灵脾3个剂量组和雷公藤组的体质量增长率均低于正常组（P＜0.05），但明显高于模型组（P＜0.05）。见表1。

3.2 大鼠足跖容积肿胀率（末次测量数据）：仙灵脾3个剂量组和雷公藤组的足跖肿胀率均高于正常组（P＜0.05）；仙灵脾3个剂量组大鼠足跖肿胀率均小于模型组（P＜0.05）。见表2。

3.3 大鼠脏器指数：各组大鼠胸腺和子宫萎缩，肝脏、脾脏和肾脏肿大指数情况见表3。

表1 大鼠体质量增长率数据（±s）

表1 大鼠体质量增长率数据（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

例数组别正常组模型组雷公藤组仙灵脾高剂量组仙灵脾中剂量组仙灵脾低剂量组888888体重增长率15.52±2.91 1.21±4.20*5.62±3.41*#5.26±1.97*#5.43±2.16*#5.27±3.51*#

表2 大鼠足跖容积肿胀率（±s）

表2 大鼠足跖容积肿胀率（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

肿胀率2.13±4.09 99.26±13.58*72.25±27.21*#64.76±17.76*#77.88±4.17*#74.10±3.52*#例数组别正常组模型组雷公藤组仙灵脾高剂量组仙灵脾中剂量组仙灵脾低剂量组888888

表3 大鼠胸腺脏器指数（±s）

表3 大鼠胸腺脏器指数（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与雷公藤组比较，△P＜0.05。

分组正常组模型组雷公藤仙灵脾高剂量组仙灵脾中剂量组仙灵脾低剂量组子宫指数0.142±0.058 0.094±0.010*0.101±0.017*0.135±0.017#△0.136±0.031#△0.115±0.020*例数888888胸腺指数0.215±0.012 0.184±0.09*0.189±0.018*0.204±0.013#0.194±0.009*0.191±0.012*肝脏指数3.779±0.664 4.242±0.156*4.253±0.181*4.142±0.175 3.941±0.168#△4.027±0.148*脾脏指数0.262±0.016 0.427±0.053*0.460±0.058*0.377±0.031*#△0.360±0.076*#△0.352±0.023*#△肾脏指数3.779±0.664 4.242±0.156*4.253±0.181*3.842±0.175#△3.941±0.168#△4.027±0.148

3.4 血清性激素：各组大鼠的E2、FSH和LH水平比较，见表4。

表4 大鼠血清性激素水平（±s，n=8）

表4 大鼠血清性激素水平（±s，n=8）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与雷公藤组比较，△P＜0.05。

分组正常组模型组雷公藤仙灵脾高剂量组仙灵脾中剂量组仙灵脾低剂量组E2（pg/L）41.70±2.89 27.96±1.25*36.20±1.89*#38.56±1.92*#△38.47±1.29*#△35.65±1.29*#FSH（mIU/L）9.02±0.23 6.51±0.67*8.05±0.26*#8.21±0.14*#7.97±0.21*#7.72±0.33*#LH（mIU/L）26.90±1.23 34.35±2.05*33.02±1.33*30.94±1.56#△31.61±0.68#31.64±1.02#

3.5 大鼠踝关节病理改变（HE染色）：空白组大鼠踝关节组织结构正常，胞浆红染，细胞形态正常；模型组大鼠关节滑膜增生，有大量炎性细胞侵润，胞浆嗜酸性增强；雷公藤组、仙灵脾3个剂量组滑膜增生不明显，偶见炎症细胞侵润，其中仙灵脾低剂量组滑膜增生明显，有少量炎症细胞侵润，见图1。

图1 各组大鼠踝关节病理变化图（HE×200）

3.6 大鼠子宫病理切片图（HE染色）：正常组大鼠子宫结构正常，内膜上皮细胞形态正常，排列整齐；模型组子宫结构正常，内膜上皮细胞水肿，局部内膜上皮细胞排列紊乱，部分脱落，黏膜下层可见淋巴细胞浸润；雷公藤组子宫结构正常，内膜上皮细胞轻度水肿，局部内膜上皮细胞排列紊乱，内膜下层淋巴细胞浸润；仙灵脾高剂量组子宫结构正常，内膜上皮细胞轻度水肿，局部内膜上皮细胞增生；仙灵脾中剂量组子宫结构正常，局部内膜上皮细胞轻度水肿；仙灵脾低剂量组子宫结构正常，局部内膜上皮细胞轻度水肿。见图2。

图2 各组大鼠子宫病理图（HE×200）

4 讨论

国内外大量的研究及流行病学调查显示，类风湿关节炎（RA）的患病人群中，女性远多于男性，男女比例为1∶3，围绝经期的女性发病率明显高于同年龄男性[4]。临床研究显示雌激素在RA发病中起到及其重要的作用，而在自身免疫反应中，雌激素可以增强体液免疫，而雄激素是天然的免疫抑制剂[5]。因此我们选择雌性动物进行实验，以体现类风湿关节炎的广泛性。

对于雷公藤应用于类风湿性关节炎的治疗早在1980年就有报道，因其独特的疗效、无药物的依赖性和停药后无反跳现象等优势，近几年又有大热的趋势。但随着人类健康需求意识和对药品安全性认识水平的不断提高，同时中药不良反应事件相关报道增多，雷公藤的临床应用始终受到其毒副作用限制[6]。中医学认为，长期服用雷公藤易损伤人体阳气，同时临床研究表明，加强补肾能减轻雷公藤对雌性鼠生殖系统的毒副作用，并能保护卵巢功能[7]。仙灵脾主要成分为淫羊藿[8]，淫羊藿味辛、甘，性温，功能补肾阳、强筋骨、祛风湿，在补肾阳减低生殖系统毒副作用的同时，兼顾祛风湿，一举两得，同时淫羊藿具有雌性激素样的作用，能促进雌性内分泌系统，上调激素样受体的表达，可以改善雌激素水平，减少由雷公藤引起的生殖系统的损伤。配伍减毒是一个很好的途径，通过合理的配伍,可达到增效减毒的效果[9]。

实验数据显示，仙灵脾配伍雷公藤在大鼠足跖容积肿胀率、大鼠各脏器指数上均较未配伍组有统计学差异，对大鼠血清性激素的检测数据显示配伍对激素控制体内分泌水平有帮助，踝关节病理切片显示滑膜增生、炎症细胞浸润等程度较未配伍组明显减轻。子宫病理切片显示局部内膜上皮细胞的增生和水肿较未配伍组明显轻微。实验结果表明仙灵脾配伍雷公藤对减少长期服用雷公藤引起的不良反应有减毒作用，对治疗类风湿关节炎等免疫性疾病亦有增效作用，由此可见，以中药的有效组分进行配伍是进一步提高雷公藤制剂临床使用效果的一条重要途径。