虎杖对高尿酸血症大鼠肾小管尿酸转运蛋白表达的影响

叶茂高

浙江省温州市中西医结合医院 浙江 温州 325000

高尿酸血症是一种因嘌呤代谢紊乱而使尿酸产生增多或尿酸排泄减少所致的代谢性疾病。高尿酸血症不仅会发展成痛风[1]，从而侵犯关节发生关节炎症和变形，并且会损害肾脏及心血管等。高尿酸血症还与糖尿病、高血压病、冠状动脉粥样硬化性心脏病、动脉粥样硬化、脑卒中等疾病的发生具有密切联系。虎杖具有清热解毒，散瘀止痛，利湿退黄等功效。临床发现其具有明显的降尿酸作用。已知尿酸主要经肾脏及肠道排泄，肾小管中的尿酸转运蛋白在排泄尿酸过程中起主要作用。目前已经发现多种尿酸转运蛋白，本实验选择其中的几个主要转运蛋白作为测定指标，以探讨虎杖的降尿酸作用机理。

1 材料

1.1 实验动物：清洁级健康雄性SD大鼠60只，体质量200±20g，由浙江中医药大学实验动物中心提供。动物生产许可证号：scxk(沪)2008-0016。

1.2 实验药物：虎杖由浙江省中医药大学门诊部制剂室提供；苯溴马隆片（昆山龙灯瑞迪制药有限公司）；腺嘌呤（美国Amresco公司）；氧嗪酸钾（苏州全辉生物科技有限公司）。

1.3 试剂：尿酸测定试剂盒、肌酐测试盒、尿素氮测试盒由德赛诊断系统（上海）有限公司提供；引物（上海生工生物工程股份有限公司）；Trizol（Invitrogen）；DEPC处理水（基尔顿生物科技有限公司）；SYBR Green PCR试剂盒（Thermo）；逆转录试剂盒（Fermentas）；异丙醇、无水乙醇氯仿（国药集团药业股份有限公司）。

1.4 主要仪器设备：低温高速离心机（北京东南仪诚实验室设备有限公司）；100℃金属浴箱（河南郑州南北仪器设备有限公司）；Real-time检测仪（ABI公司，型号ABI-7300）；低温冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司，型号TG-16M）；旋涡振荡器（青浦泸西仪器厂，型号K30）；电动匀浆机（FLUKO，型号PRO200）。

2 方法与结果

2.1 实验动物分组：SD大鼠60只以10只为1组随机分为6组：空白组、模型组、西药组和虎杖低剂量组、中剂量组、高剂量组。

2.2 模型建立与药物干预：各组自由供给水与普通大鼠饲料，适应性喂养1周后，除空白组外，其余每组每日上午参照目前较为成功的高尿酸血症造模方法，予以腹腔注射氧嗪酸钾联合腺嘌呤灌胃建立高尿酸血症大鼠模型[2]。氧嗪酸钾的剂量为200mg/kg，腺嘌呤为100mg/kg。下午除空白组外，模型组予生理盐水10ml/kg灌胃，西药组予苯溴马隆11mg/kg灌胃，分别予虎杖不同剂量组虎杖低0.54g/kg、中1.08g/kg、高2.16g/kg灌胃（剂量换算根据动物与人体的每千克体质量剂量系数折算表，大鼠约为人的6.3倍)。连续灌胃3周。

2.3 样本采集：在第20～21天将大鼠放入代谢笼收集24小时尿液，计24小时尿量，检测尿液中尿酸。于第21日给药后1小时眼眶静脉取血，静置30min后用离心机以3000转/分钟离心5分钟取血清，并检测血尿酸、血肌酐、尿素氮。

2.4 取肾组织及荧光定量PCR检测：分述如下。

2.4.1 肾组织收集：予1.5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，用剪刀将老鼠腹部剪开，取肾组织，剪取肾皮质放于无菌冻存管内，液氮速冻2h后，置于-80℃冰箱保存。

2.4.2 引物设计：GLUT9、URAT1、OAT3引物参照文献，根据大鼠基因全序列设计，并选用生物体内恒定表达的GAPDH作为内参，由上海生工生物工程公司合成。GAPDHPrimer F，5'-ATCACTGCCACCCAGAAG-3'，GAPDHPrimer R，5'-TCCACGACGGACACATTG-3'，PCR产物长度为191bps；GLUT9，Primer F，5'-TGAAACACTGGCTGCTATC-3'，GLUT9，PrimerF，5'-TGAAACACTGGCTGCTATC-3'，PCR产物长度为 164 bps；URAT1，5'-GAGGAACCAAGCAGGGACAAAG-3'，URAT1，PrimerF，5'-GCCGTAGAAGGTGAAGCCAAAG-3'，PCR产物长度为123 bps；OAT3，5′-CATCTTGCCTGGTGCCATGAC-3′，OAT3，PrimerF，5′-TACTGCTTGGGATCAGTCTCTTGTG-3′，PCR产物长度为105bps。

2.4.3 组织总RNA的提取：取肾组织放入1ml的Trizol的匀浆管中匀浆，充分裂解组织，酚氯仿法提取组织Total RNA取1μg反转录制备cDNA，使用随机反转录引物Random Primer，然后取1μl反转录产物进行PCR检测。PCR的反应总体系为25μl：SYBRGreen Mix 12.5μl，上游引物 F 0.5μl，下游引物 R 0.5μl，ddH2O 9.5μl，cDNA模板2μl。反应程序：95℃，10min（95℃，15s；60℃，45s）×40；95℃,15s；60℃,1min；95℃,15s；60℃,15s；数据采用仪器自带软件分析：ABI Prism 7300 SDS Software。

2.5 统计学方法：上述实验所得实验数据由SPSS19.0软件统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组数据采用t检验分析，多组数据采用单因素方差分析，各处理组间两两比较采用LSD-t法检验。以SPSS19.0 for windows软件进行分析，P＜0.05为有统计学差异。

3 结果

3.1 各组大鼠造模前后血尿酸、肾脏指数比较：第3周末，模型组大鼠的血尿酸值、肾脏指数较空白组均有明显升高，有显著性差异(P＜0.01)；中药低、中、高剂量组大鼠血尿酸值较模型组均有下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。实验过程中中药高剂量组死亡1只，故中药高剂量组剩余9只，其余各组大鼠无死亡。见表1。

表1 各组大鼠造模前后血尿酸值比较（±s，μmol/L）

表1 各组大鼠造模前后血尿酸值比较（±s，μmol/L）

注：与空白组比较，△P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与西药组比较，*P＜0.05。

第21天尿酸值111.96±12.99#333.55±65.88△159.32±62.20#*229.32±34.61#198.43±47.62#212.85±45.76△#组别空白组模型组低剂量组中剂量组高剂量组西药组只数10 10 10 10 9 10造模前尿酸值99.36±5.06 101.88±14.14 97.71±6.64 112.41±7.04 101.50±14.49 106.71±15.48

3.2 药物干预3周后各组大鼠血肌酐、尿素氮：第3周末，模型组大鼠的血肌酐、尿素氮水平较空白组均有明显升高(P＜0.01)。中药低、中、高剂量组及西药组大鼠血肌酐水平较模型组均有下降，但经过统计学分析，无显著性差异(P＞0.05)。中药低、中、高剂量组及西药组较模型组大鼠尿素氮水平均有明显下降，有统计学差异(P＜0.05)。见表2。

表2 各组大鼠干预3周后血肌酐、尿素氮比较（±s）

表2 各组大鼠干预3周后血肌酐、尿素氮比较（±s）

注：与空白组比较，△P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

尿素氮（mmol/L）5.07±0.77#11.59±2.99△8.42±1.67#8.89±1.75#7.80±0.74#8.10±1.22#组别空白组模型组低剂量组中剂量组高剂量组西药组只数10 10 10 10 9 10血肌酐（μmol/L）51.97±3.86#63.20±8.36△60.24±4.05△62.26±4.91△56.70±2.13 59.77±5.99△

3.3 各组大鼠第3周末尿量及尿尿酸水平比较：第3周末，模型组大鼠的尿尿酸量较空白组有明显升高，有显著性差异(P＜0.05)；中药低、中、高剂量组大鼠尿尿酸较模型组均有增多，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表3。

表3 第3周末各组SD大鼠尿尿酸值比较（±s）

表3 第3周末各组SD大鼠尿尿酸值比较（±s）

注：与空白组比较，△P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与西药组比较，*P＜0.05。

尿尿酸（μmol/L）713±54.2#1457±325△1739±418#*1746±436#*1851±309#1913±295#组别空白组模型组低剂量组中剂量组高剂量组西药组只数10 10 10 10 9 10 24h尿量（ml）23.5±4.1#16.93±4.8△18.37±3.1#*19.74±4.6#*19.61±3.9#*20.13±4.4#

3.4 药物干预后高尿酸血症大鼠肾组织中尿酸盐转运体1(URAT1)mRNA、葡萄糖转运体9(GLUT9)mRNA和有机阴离子转运体3（OAT3）mRNA表达水平的比较：造模后，模型组的URAT1mRNA、GLUT9mRNA的表达比空白组明显增强，而OAT3mRNA的含量明显减少（P＜0.05）。药物干预后，中药虎杖低剂量组的URAT1mRNA、OAT3mRNA和中剂量组的GLUT9mRNA、OAT3mRNA，以及高剂量组URAT1mRNA、GLUT9mRNA和OAT3mRNA与模型组比较，均有显著性差异（P＜0.05）。表明中药虎杖对高尿酸血症大鼠肾组织中URAT1mRNA、GLUT9mRNA表达有抑制作用，而对OAT3mRNA表达有增强作用。见表4。

表4 PCR检测各组大鼠肾组织GLUT9mRNA、URAT1mRNA和OAT3mRNA表达的比较（±s）

表4 PCR检测各组大鼠肾组织GLUT9mRNA、URAT1mRNA和OAT3mRNA表达的比较（±s）

注：与空白组比较，△P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与西药组比较，*P＜0.05。

2-ΔΔCt值组别空白组模型组低剂量中剂量高剂量西药组只数10 10 10 10 9 10 OAT3mRNA 1.02±0.095#0.57±0.130△0.91±0.167#*0.89±0.167#*1.01±0.157#1.07±0.188#URAT1mRNA 0.99±0.096#1.378±0.115△1.08±0.152#*1.16±0.083*1.08±0.129#*0.94±0.113#GLUT9mRNA 0.80±0.076#0.98±0.103△0.86±0.121*0.73±0.108#*0.75±0.099#*0.96±0.117

3.5 荧光定量PCR检测各组大鼠肾组织中GLUT9mRNA、URAT1mRNA和OAT3mRNA表达量之间的比较：第3周末，GLUT9mRNA在模型组大鼠肾组织中表达水平较空白组有明显升高(P＜0.05)。中药中、高剂量组大鼠较模型组大鼠的GLUT9mRNA表达水平均有明显下降(P＜0.05)。西药组较模型组大鼠的GLUT9mRNA表达水平均无明显下降(P＞0.05)。中药低、中、高剂量组大鼠较西药组大鼠的GLUT9mRNA表达水平升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。URAT1mRNA在模型组大鼠肾组织中表达水平较空白组明显升高(P＜0.05)。与模型组比较，中药低、高剂量组及西药组大鼠的URAT1mRNA表达水平均有明显下降(P＜0.05)。西药组大鼠较中药中、高剂量组大鼠的URAT1mRNA表达水平降低，差异无统计学意义(P＜0.05)。OAT3mRNA在模型组大鼠肾组织中表达水平较空白组明显降低，有显著性差异(P＜0.05)。中药低、中、高剂量组，西药组大鼠较模型组大鼠的OAT3mRNA表达水平均有明显升高(P＜0.05)。西药组大鼠较中药低、中剂量组鼠的OAT3mRNA表达水平明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图1。

图1 虎杖对各组大鼠GLUT9、URAT1及OAT3mRNA表达的影响

4 讨论

高尿酸血症是嘌呤代谢异常所导致的代谢性疾病，其病因主要由尿酸的产生异常增多及尿酸的排泄减少所导致[1，3]。本实验中模型组的血尿酸水平及血肌酐与空白组对照比较可以证明高尿酸血症大鼠模型是成功的。

中医药临床治疗高尿酸血症有显著优势[4]。有必要对其作用机制进行进一步研究。本实验中虎杖组治疗血尿酸水平较模型组明显降低，实验结果证明虎杖的降尿酸作用是明确的。不同剂量的虎杖组在21天治疗后的血尿酸水平并不是根据虎杖药物浓度的递增而依次下降，可能与样本量不够导致低剂量虎杖组的个别大鼠造模失败有关。其后各组血肌酐、尿素氮及24小时尿尿酸结果均证明虎杖具有明显的降尿酸作用，从而减少高尿酸血症对肾脏的损害。其中低浓度虎杖组的各指标水平均低于中剂量、高剂量虎杖组检测结果，考虑原因同前。

尿酸主要经肾脏及肠道排泄，其中2/3是通过肾脏排泄[1]。尿酸经肾脏的排泄过程主要经过转运蛋白实现。目前研究发现，转运蛋白URAT1[5]、OAT1、OAT3[6]等在肾脏排泄尿酸的作用中起到重要作用。近几年发现，转运蛋白GLUT9也具有重吸收尿酸的作用[7]。本实验中，相较空白组，模型组大鼠的GLUT9、URAT1的mRNA表达水平升高，OAT3的mRNA表达受到抑制，各虎杖组中的GLUT9、URAT1的mRNA表达不同程度受到抑制，OAT3的mRNA表达不同程度的提高。结果表明虎杖能通过影响肾脏的转运蛋白GLUT9、URAT1、OAT3的mRNA表达，从而起到促进尿酸排泄的作用。