川芎-天麻对偏头痛模型大鼠三叉神经中脑核多巴胺D2受体表达的影响*

程 静 章正祥 朱 红 陈 强 唐毅华 侯 群 龚敏操 张伟骏

1 浙江省台州市中心医院 浙江 台州 318001

2 浙江中医药大学附属第一医院 浙江 杭州 310006

3 浙江中医药大学第一临床医学院 浙江 杭州 310053

偏头痛发病机制尚未完全阐明，尤其对多巴胺D2受体如何在偏头痛机制起作用仍然知之甚少。我们通过硝酸甘油诱导偏头痛模型大鼠，预防给药川芎-天麻和利扎曲普坦，用免疫组织化学漂片染色法检测中脑导水管周围灰质（PAG）腹外侧边缘多巴胺D2受体的表达，观察偏头痛模型大鼠三叉神经中脑核（Vme）区域D2受体表达是否存在改变，以及川芎-天麻干预偏头痛模型大鼠是否存在多巴胺机制改变。

1 材料

1.1 实验动物：SPF级别SD雄性大鼠25只，购自上海西普-必凯实验动物有限公司，许可证号：SCXK（沪）2013-0016。分笼饲养于浙江中医药大学动物实验中心。

1.2 实验药品及试剂：硝酸甘油注射液（20150814）：北京益民药业有限公司。苯甲酸利扎曲普坦（160403）：湖北欧立制药有限公司。川芎配方颗粒（1603061）和天麻配方颗粒（1602112）均来自江阴天江药业有限公司。兔抗大鼠D2多克隆抗体（GR153272-17）：德国calbiochem公司。

1.3 实验器材及主要仪器设备：超纯水仪D11931：美国BARNSTEAD公司。冰冻切片机HM550 VPD：美国Thermo SCIENTIFIC公司。-80℃超低温冰箱702：美国Thermo SCIENTIFIC公司。-20℃冰箱MDF-U338-C：大连三洋冷链有限公司。病理切片扫描仪annoramic：匈牙利3DHISTECH公司。

2 实验方法

2.1 动物准备：25只健康SD雄性大鼠于标准环境。动物实验遵循国家科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》的要求，尽可能减少动物的痛苦。适应性饲养后，体重在290～320g之间，将动物随机分成5组，并保证了各组间体重比较无差异，分别为空白组、对照组、模型组、西药组、中药组，每组各5只。

2.2 药物干预：空白组不灌胃，对照组和模型组灌胃超纯水（给药体积1ml/100g），西药组灌胃利扎曲普坦悬浊液（给药剂量：0.816mg/kg，给药体积：1ml/100g)，中药组灌胃川芎天麻配方颗粒悬浊液(川芎天麻饮片给药剂量：3062mg/kg，给药体积：1ml/100g，相当于川芎：天麻=4：1）。每组连续灌胃7天，每日1次。

2.3 造模：在第7天灌胃结束后，于透明钢化玻璃箱（长宽高30cm灌胃结束后）中适应0.5小时后，模型组、西药组、中药组腹腔注射硝酸甘油（给药剂量：10mg/kg，给药体积：0.2ml/100g），对照组腹腔注射生理盐水（给药体积：0.2ml/100g），空白组不作处理。

2.4 行为学观察：造模完成后，将大鼠放回玻璃箱中，将高清摄像机架在玻璃箱上方，保持室内环境安静，对所有大鼠进行4小时行为学录制。录制完成后，根据录像观察行为，记录下每个行为出现或结束的时间，并统计各个行为出现的次数。主要观察以下2个行为学指标：①用双后肢站立，双前肢无任何支撑，但并不代表身体要和箱底相垂直，身体完全伸展和不完全伸展均为站立，站立后若双前肢触及笼壁仍记作一次站立。②爬笼：保持直立的姿势靠在箱壁上，包括单个前肢和双前肢接触箱壁，爬笼后若双前肢离开箱壁仍记作一次爬笼。

2.5 取材及指标测定：各组大鼠在行为学录制后，即造模后4小时后，腹腔注射1%戊巴比妥钠（给药剂量：50mg/kg，给药体积：0.5ml/100g），使大鼠完全麻醉后剪开两侧肋骨，止血钳夹住胸骨下端翻转至头侧，暴露出心脏。左手固定住心脏，右手持灌胃针头刺入心尖，向前推进，直至灌胃针头部进入主动脉。用止血钳完全夹住整个心脏，手术剪剪破右心耳，同时止血钳夹闭腹主动脉。注射器抽取一定量的生理盐水，连接灌胃针头，将液体推入主动脉，从右心耳流出，连续推注几次，直至流出液体澄清。接着灌注4%多聚甲醛磷酸缓冲液，先快后慢灌注，直至上肢及颈部僵硬。固定结束后，剪开颈部皮肤，剪断颈椎，剥离颈部和头部两侧肌肉，用止血钳依次剥离开颈椎、枕骨大孔、颅顶的骨片，然后离断颅底神经，取出脑组织，特别注意剥开硬脑膜。取出后，立即放入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液中再固定12～24h，再用4℃30%蔗糖-PBS液脱水72h，擦干表面液体，铝箔纸包裹脑组织，标记好分组及编号，于液氮中速冻10～15s，存于-80℃冰箱。

2.6 免疫组织化学法染色检测多巴胺D2受体蛋白表达：分述如下。

2.6.1 切片制备：根据《大鼠脑立体定位图谱》(6版)对PAG腹外侧边缘的Vme进行定位。冰冻切片机连续切片，厚度为30μm，每3张取1张，每个标本各取3张。

2.6.2 试剂配制：①取100μl山羊血清，加入900μl 0.3%的PBST中，配制成10%的山羊血清PBST溶液。②取1μl D2抗体原液加入2000μl一抗稀释液，配制成1：2000的D2抗体稀释液。③DAB溶液：在1ml DAB底物液中加入1滴（约50μl）DAB浓缩液，充分混匀，现用现配，配好后避光保存，6小时内使用。

2.6.3 免疫组织化学染色（漂染法）：①切片收集于0.01M的PBS液中；②用3%的双氧水孵育15分钟；③PBS液漂洗3分钟，共3次；④吸干PBS液，放入10%的山羊血清中，封闭30分钟；⑤一抗4℃孵育48小时；⑥PBS液漂洗15分钟，共3次；⑦加入二抗：山羊抗兔IgG/HRP聚合物，37℃孵育20分钟；⑧PBS液漂洗10分钟，共3次；⑨DAB溶液显色4～5分钟；⑩PBS液漂洗3分钟，共3次；⑪贴片，37℃烘干；⑫85%、90%、95%、95%、100%、100%乙醇梯度脱水各2min；⑬将中性树胶与二甲苯以1：1的浓度均匀混合后封片。

2.6.4 图片分析：所有切片用病理切片扫描仪扫描后，在同一放大倍数（×3.5或×20.0）进行照片采集。每只大鼠分左右两侧各取3张含PAG腹外侧边缘区域的Vme切片，用Photoshop cs6计数工具进行计数，三张切片合计总数，两个人计数后取均值，并分左右进行统计。三叉神经中脑核又叫Cajal间质核，1988年罗玉福等人按突起多寡及中枢突分叉处距胞体的远近分为ⅠA、ⅠB，ⅡA、ⅡB，ⅢA、ⅢB，ⅣA、ⅣB神经元，其中ⅢB，ⅣA、ⅣB邻近蓝斑、蓝斑下核、臂旁内侧核（MPB）和中脑导水管周围灰质（PAG）。

2.7 统计学方法：采用SPSS 25.0软件，正态计量资料以均数±标准差（±s）表示，左侧三叉神经中脑核D2阳性细胞个数方差不齐者，转化为log10(L)，符合正态分布，且方差齐。各组三叉神经中脑核D2阳性细胞个数左右比较采用配对t检验。采用单因素方差分析，其中两两比较，方差齐者采用Tukey法；各组资料均以α=0.05为显著性水平。

3 结果

3.1 行为学结果：造模后，对大鼠行为学录像资料进行观察。对4小时视频进行大致观察，我们发现，空白组和对照组大鼠站立和爬笼次数较多；而模型组、西药组以及中药组大鼠几乎无站立和爬笼。

3.2 免疫组织化学染色结果：模型组左侧多巴胺D2受体阳性细胞个数较对照组左侧、空白组左侧明显增多，差异具有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）；与中药组左侧、西药组左侧相比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组右侧多巴胺D2受体阳性细胞个数较对照组右侧明显增多，差异具有统计学意义（P＜0.05），与其他各组右侧比较，均无统计学意义（P＞0.05）。各组三叉神经中脑核D2阳性细胞个数左右比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 三叉神经中脑核多巴胺D受体阳性细胞表达比较（±s）2

表1 三叉神经中脑核多巴胺D受体阳性细胞表达比较（±s）2

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

例数组别空白组对照组模型组西药组中药组55555左侧（个）13.10±2.61*9.60±2.13**23.40±7.83 23.20±6.34 16.00±3.79右侧（个）16.40±3.27 11.60±5.63*21.10±4.23 22.20±3.07 17.90±6.26

图1 各组大鼠免疫组织化学染色结果

4 讨论

本研究结果说明，多巴胺D2受体在硝酸甘油诱导的偏头痛模型大鼠PAG腹外侧边缘区域的Vme中存在高表达，这与既往研究一致。Vme位于中脑和脑桥的吻侧，是一个很独特的核团，是唯一的位于中枢内的初级感觉神经元，形态和功能上都与其它外周神经节相似，其中枢突在脑干内的投射极为广泛，但目前对各投射区域具体执行何种功能仍不是十分清楚。多巴胺D2受体激活诱导腺苷酸环化酶的抑制，伴随着cAMP水平的快速降低，并激活K+通道和抑制Ca2+通道，最终引起细胞的超极化。本研究结果显示硝酸甘油诱导的偏头痛大鼠存在Vme中的D2受体表达增多。可以推测，一些偏头痛的颈部僵硬和喜欢卧床休息的特点可能与Vme的多巴胺D2受体激活有关。

结合古今“头痛”“头风”等相关文献研究，中医学一般认为肝失疏泄是本病发病的病理基础，风、寒、火、痰、虚、瘀是偏头痛的重要病机特点[1]。在治疗头痛的所有方药中，川芎、天麻是常用药对，该药对也是一个方剂，即《宣明论方》的大川芎丸或《本草纲目》天麻丸,后者记载：“天麻丸消风化痰，清利头目，宽胸利膈。治……偏正头痛……并宜服之。天麻半两，川芎二两，为末，炼蜜为丸如芡子大。”川芎-天麻比例4∶1。天麻可延长川芎中阿魏酸、川芎嗪在体内的作用时间，川芎天麻(4∶1)组对治疗血瘀型偏头痛疗效最好。

中药组D2受体表达相比于模型组虽无统计学差异，但有下降趋势，需要扩大样本量进一步研究。另外川芎配天麻常用于血瘀型和肝阳上亢型偏头痛，但本实验并未设置相关对照组。中药和方剂的作用往往是多方位和复杂的，进一步验证与D2受体表达的关系，还需要我们增加实验分组进行蛋白和基因水平上的检测，有望发现关于川芎-天麻治疗偏头痛多巴胺机制更为精确的结果。