p16异常甲基化联合高危人乳头瘤病毒检测在早期宫颈癌诊断中的临床价值

鲍统惠，郭桂兰，李武芬，祁璘

宫颈癌是临床上最为常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率极高，仅次于乳腺癌，位居第2位，多见于发展中国家的中老年女性，但是随着社会的发展及人们生活水平的提高，宫颈癌的发生正趋于年轻化并有明显上升趋势[1]。调查显示，全球每年大约有48万女性被确诊为宫颈癌，有大约25万的宫颈癌患者死亡[2]。宫颈癌患者的预后与其临床分期存在很大的关系，在美国，宫颈癌患者从确诊以后计算，5年的病死率大约为30%，如果患者能够被早期确诊，病死率可降低20%[3]。另外由于宫颈癌的发展是一个长期量变产生质变的过程，前期病变也是可以逆转的，所以宫颈癌的早期诊断在降低病死率、提高生存率方面有着重要的意义[4]。目前，临床上已公认高危人乳头瘤病毒(HPV)的持续性感染是宫颈癌癌前病变及进一步恶化的关键，但是高危HPV感染并不一定能够促使形成宫颈癌[5]。有研究显示，机体抑癌基因表达的失活通常是通过相关基因启动子区的异常甲基化引起的，在肿瘤发展的整个过程中，甲基化是早期发生的事件，可作为一种新型的肿瘤分子标志物[6]。现分析p16异常甲基化联合高危HPV检测在早期宫颈癌诊断中的价值，为其临床诊断提供参考，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2018年3月—2019年3月在青海大学附属医院妇科行门诊活检、子宫全切术及宫颈环形电刀切除术患者100例(病例组)作为研究对象，根据其宫颈上皮是否存在异性细胞、细胞核分裂相、极性及异型细胞侵犯上皮细胞的程度分为宫颈癌亚组20例，年龄31～75(45.32±6.27)岁，按照我国2016年FIGO规定的的临床分期[7]，Ⅰ期3例，Ⅱ期7例，Ⅲ期6例，Ⅳ期4例；高度病变亚组(CINⅡ～Ⅲ期)35例，年龄30～74(44.98±6.17)岁；低度病变亚组45例，年龄31～74(45.20±6.41)岁。另取正常人宫颈组织30例作为健康对照组，年龄31～73(44.53±6.39)岁。4组受试者年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会审核批准，受试者及家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 选择标准 (1)纳入标准：①所有患者均为已婚女性，存在完整的宫颈；②均同意行宫颈癌活性病理检查；③临床资料完整。(2)排除标准：①心肝肾等功能障碍、精神障碍及并发有其他肿瘤疾病者；②长时间使用激素及免疫制剂者；③已接受生物、化疗及放疗者；④严重感染及自身免疫病史者；⑤已有显著的宫颈癌临床症状者；⑥依从性差，中途退出者。

1.3 观察指标与方法

1.3.1 p16异常甲基化检测[8]：提取所有受试者宫颈组织的DNA，之后对其进行甲基化处理：①取宫颈组织的DNA 1～2 μg ，加入20 μl生理盐水，再加入NaOH溶液3 mol/L调节浓度至0.3 mol/L，置于37℃条件下15 min；②加入新配浓度为10 mmol/L氢醌溶液调节浓度至5 mmol/L，再加入浓度为3.6 mol/L新配置的亚硫酸氢钠调整为3.1 mol/L的最终浓度，最后加入矿物油，置于50℃条件下16 h；③再向上述样品中加入适量3 mol/L NaOH溶液调节浓度至0.3 mol/L，置于37℃条件下15 min；④加入浓度为20 μg/μl糖原1 μl，加入浓度为8 mol/L醋酸氨溶液，调节样品溶度为3 mol/L，按照样品体积，加入2.5倍量的无水乙醇，-20℃条件下过夜。之后再通过甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)。阳性对照选用Sssl甲基转移酶修饰的胎盘DNA，操作方法严格按照说明书执行。亚硫酸氢盐修饰完全判断：同一DNA在修饰前后均用非甲基化特异性引物和甲基化特异性引物扩增，即如果修饰前无目的条带发生扩增现象，而修饰后存在目的条带扩增现象，则为修饰完全。相关引物由赛百盛基因技术有限公司合成，见表1。

表1 MSP引物序列

注:U为非甲基化特异性内侧引物;M为甲基化特异性内侧引物

1.3.2 宫颈组织p16蛋白表达检测[9]：采用Western-blot法检测。制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶，将提取处理后的蛋白质样品向样品孔中点样30 μg，之后按照电泳操作方法进行电泳。再进行转膜处理，在装有蛋白的PVDF膜朝上，加入5%的封闭液，在4℃条件下摇床封闭3 h。之后加入兔抗人p16单克隆抗体(1 ∶1 000，购自Abcam公司)，为一抗，在4℃条件下孵育过夜，TBST进行洗涤操作，共3次，每次15 min。之后再加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(1 ∶1 000，购于上海信裕生物技术有限公司)，为二抗。在37℃条件下，孵育1 h，TBST进行洗涤操作，共3次，每次15 min。将上述经过处理的PVDF膜浸入到发光工作液中，室温条件下，孵育1 min，沥干后显影保存，之后通过Quantity One软件对电泳条带光密度值进行分析，将内参β-actin与目的条带光密度值进行对比，计算得出p16蛋白表达的相对量。

1.3.3 高危HPV病毒载量检测[10]：通过第二代杂交捕获试验(HC-Ⅱ人乳头状瘤病毒检测技术)测定。医生采集每例患者的宫颈细胞，做好标记；另外，患者自身采用dacron棉签放入阴道6～7 cm深左右，静止30 s后，转动棉签取出即可，放置于做好标记的试管中。通过碱性溶液破坏患者体内病毒，使DNA双链裂解成单链；通过RNA探针可以与病毒单链特异性结合形成杂交复合物；再通过其特异性抗体将复合物粘合于微孔壁上；之后杂交复合物会与碱性磷酸酶的多个抗体相结合，放大信号；最后，由于底物于碱性磷酸酶结合会发光，通过判定其发光强弱可以判定碱性磷酸酶的含量，从而确定杂交复合物的含量。阳性判定标准：对于上述2组待检样品，其中任何1组发现检出的杂交复合物含量≥1.0 pg/ml时即可判定为阳性感染。采用聚合酶链式反应反向点杂交法对高危HPV病毒载量进行检测，试剂盒购自深圳亚能生物技术有限公司，操作方法严格按照说明书执行。

2 结 果

2.1 4组高危HPV及p16异常甲基化阳性率比较 高危HPV和p16异常甲基化的阳性率比较，宫颈癌亚组>高度病变亚组>低度病变亚组>健康对照组(P均<0.01)，见表2。

表2 4组受试者高危HPV及p16异常

2.2 高危HPV病毒载量、p16蛋白表达量与宫颈病变程度的关系 随着宫颈癌病变程度的不断加重，其HPV病毒载量呈现增加趋势，两者呈正相关(r=0.692,P<0.01)。随着宫颈癌病变程度的不断加重，p16蛋白表达量也逐渐增加，两者呈正相关(r=0.554,P<0.01)，见表3。

2.3 3种检测方法诊断早期宫颈癌的ROC曲线分析 p16异常甲基化、高危HPV及p16异常甲基化+高危HPV的AUC分别为0.62、0.74、0.98；p16异常甲基化+高危HPV的敏感度、特异度、阴性预测值、阳性预测值及约登指数明显高于单项检查，见表4、图1。

表3 高危HPV病毒载量、p16蛋白表达量与宫颈病变程度的关系 [例(%)]

表4 3种诊断方法对早期宫颈癌的cut-off值、敏感度及特异度

图1 p16异常甲基化、高危HPV及联合诊断的ROC曲线分析

3 讨 论

大量研究显示，许多肿瘤细胞呈现特定区域的CpG岛高甲基化和整体基因组低甲基化，另外也有研究认为抑癌基因失活的主要机制为启动子高甲基化[11]。实际上，肿瘤发生的本质是抑癌基因的失活及癌基因的激活。p16基因主要位于人类第9号染色体短臂上，是一个可直接参与细胞周期调控的抑癌基因，与诸多癌症的发生关系密切[12]。CyclinD1能与p16功能蛋白竞争性地结合CDK4/CDK6，会对pRb蛋白磷酸化产生抑制，促使pRb-E2F复合物中的E2F难以解离，对细胞DNA合成和G1期进入S期的启动具有较好的阻止效果，负反馈调节细胞增殖周期，另外pRb-E2F复合物水平的升高也反馈性地对p16的表达产生抑制[13]。Tong等[14]研究显示，p16基因失活与肿瘤的发生关系密切，p16基因的失活主要包括甲基化、突变及缺失。Stiasny等[15]认为诸如垂体瘤、鼻咽癌及肺癌等多种肿瘤发生主要与p16基因的异常甲基化有关。本研究正常人和宫颈癌患者p16基因甲基化率分别为0%和45%，也证实了宫颈癌的发生与p16基因甲基化有关。而随着癌变程度的增加，p16异常甲基化越显著，提示在宫颈癌发生之前已有p16基因启动子发生了甲基化，并逐渐恶化，有利于对宫颈癌癌变级别进行预测，可作为一种新型的肿瘤分子标志物。与Ahmad等[16]的研究结果相符合。Yildirim等[17]研究显示，正常宫颈组织中p16蛋白不表达，而在宫颈癌中呈现高表达，且与病变程度呈正相关，与本研究中结果相符。对此，临床上有2种解释[18]：(1)宫颈癌发生时，Rb基因失活致使功能性pRb蛋白缺失，解除机体对p16基因的抑制，升高p16蛋白的表达；(2)HPV16癌基因E7可诱导pRb蛋白降解或者失活，可通过pRb与p16之间的负反馈调节，诱导p16蛋白高水平表达。

宫颈癌患者宿主细胞中整合的高危HPV基因组，会持续性地对E6/E7癌基因进行表达，进而维持癌细胞的生长[19]。HPV E6/E7主要通过影响细胞周期中的Rb蛋白和调节因子P53发生致癌机制。E7与Rb蛋白相结合，会使pRb-E2F中的转录因子E2F释放出来，影响G1/S的启动，进而激活细胞周期，促使细胞非控制性增长[20]。E6可与P53蛋白特异性结合，使其丧失对细胞的负生成调节功能[21]。本研究结果显示，高危HPV病毒载量与宫颈病变程度呈正相关，且各病变程度患者HPV阳性率与Tsakogiannis等[22]研究相符。而经过ROC曲线分析联合诊断的价值最高，这主要是由于HPV E7和p16基因均作用于以pRb为中心的pRb-E2F通路，而p16在G1～S期增殖过程中起着重要的作用，p16基因的甲基化会促使上述通路无限制进行，形成肿瘤[23]。据研究，人类癌症细胞中pRb与p16基因水平呈负相关，两者共同参与癌症通路的抑制，破坏上述两种的任一基因，均会促使细胞发生异常增生，两者同时缺失会引起选择性压力缺乏[24]。随着研究的不断深入，发现单一高危HPV感染通常不会直接引起细胞发生癌变。Celewicz等[25]研究发现不同级别病变的高危HPV阳性宫颈癌亚组中均出现一定程度的p16甲基化，且出现p16甲基化的细胞大部分病变较为严重，故p16甲基化可能是促使低病变向高病变发展的诱导因子。

综上所述，p16异常甲基化联合高危HPV检测对早期宫颈癌具有较高的诊断价值，值得临床推广应用。