miR-221-3p、miR-125b-5p、miR-183-5p在甲状腺癌中的表达及其诊断价值分析

梅士娟，张双元，张易青，马淑梅，孔令达

甲状腺癌是常见的内分泌肿瘤，全球每年约新发30万例，死亡4万例[1-2]。甲状腺乳头状癌是最常见的组织学类型，占所有甲状腺癌的80%～90%，10年生存率超过90%，但若发生淋巴结转移(在5%～20%的甲状腺全切除术患者中可观察到区域复发) ，尤其是颈部淋巴结转移(占所有患者的20%～50%)，易导致生存率降低[3-4]。由于甲状腺癌患者存活和肿瘤复发的危险因素存在差异，颈淋巴结转移对预后的影响存在争议。因此，急需寻求生物敏感标志物解决这一问题[5]。微小RNA(miRNA)是小的(19～25个核苷酸)非编码单链RNA，其在癌症发展和转移相关过程中起重要作用。与未受影响的甲状腺组织相比，已显示几种miRNA在甲状腺癌中转录失调[6-8]。miR-221-3p过表达与乳腺癌转移相关，随后证实与其他类型癌症的转移发展相关。miR-125b-5p上调与非小细胞肺癌、肝细胞癌、乳腺癌和结直肠癌中的淋巴结转移相关[9]。相反，miR-125b-5p下调也与透明细胞肾细胞癌、胃癌和复发性浆液性乳头状卵巢腺癌的转移相关。miR-183-5p是最早被发现的miRNA之一，它的上调与多种癌症相关。现分析miR-221-3p、miR-125b-5p与miR-183-5p在甲状腺癌中的表达及其诊断价值，为甲状腺癌的治疗提供临床及理论依据，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2016年4月—2018年12月青海大学附属医院肿瘤外科确诊并有完整随访资料的甲状腺乳头状癌患者138例，经临床颈部超声诊断及甲状腺全切除或次全切除术后病理检查确诊，术前均未接受化疗或放疗。其中男69例，女69例，年龄47～68(57.5±10.8)岁；病程4～25个月，平均(6.5±2.4)月；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期88例，Ⅲ～Ⅳ期50例。手术切除标本后行病理检查以判定肿瘤大小、复发、临床分期、血管间隙浸润、转移。选择同期于医院诊治的甲状腺结节患者138例作为对照组(自愿提供甲状腺组织用作分析miR-221-3p、miR-125b-5p与miR-183-5p的表达)。本研究经医院伦理委员会审核批准，受试者及家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 选择标准 (1)纳入标准：患者的预计生存期均>3个月。(2)排除标准：同步接受其他肿瘤放疗的患者；服用或可能服用致肝损害药物的患者；存在其他重大器官疾病的患者。

1.3 观测指标与方法 通过TRIzol试剂(碧云天科技公司)提取总RNA。1.5%琼脂糖凝胶电泳和UV分光光度计(美国HyClone公司)检查RNA样品的纯度和浓度。使用2 μg总RNA及逆转录试剂盒(美国Sigma公司)合成cDNA。引物由上海生工科技公司合成。miR-221-3p正向引物为5'-CCTGAGATGCAGGGTCCGAGGTAGGTCTA-3'，反向引物为5'-TTGCGGACATTGCTTGCTA-3'；miR-125b-5p正向引物为5'-CCTGACCTGCTAGGTAGCCTG-3'，反向引物为5'-CTGATCGTAGCTTGCTATTGCTGA-3'；miR-183-5p正向引物为5'-GGTTTCATCCAGGATCGAGCAGG-3'，反向引物为5'-ACAAAGATGGTCACGGTCTGCC-3'；内源性对照GAPDH正向引物为5'-CGCGAGAAGATGACCCAGAT-3'，反向引物为5'-GCACTGTGTTGGCGTACAGG-3'。PCR反应条件为95℃ 5 min，然后进行30个循环，95℃ 30 s，58℃ 30 s和72℃ 60 s，72℃10 min。PCR反应系统：cDNA 2 μl +每种引物3 μl +Taq聚合酶(Sigma公司生产)0.5 μl +dNTP 1 μl +10×缓冲液2 μl，加入生理盐水以使最终体积为20 μl。以GAPDH作为内部对照，以2-ΔΔCt作为计算方法[10]，依据miR-221-3p、miR-125b-5p与miR-183-5p mRNA 2-ΔΔCt计算结果，确定miR-221-3p>3.76、miR-125b-5p>5.43、miR-183-5p>6.21为阳性。

2 结 果

2.1 2组临床资料比较 与对照组比较，病例组患者性别、年龄、基础病、家族遗传史、身高、体质量、TG、HDL-C、LDL-C、舒张压、收缩压比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 2组一般情况比较

2.2 2组miRNA表达水平比较 与对照组比较，病例组miR-221-3p、miR-125b-5p、miR-183-5p水平明显升高(P<0.01)，见表2。

2.3 miRNA在甲状腺癌患者中的变化特征 miR-221-3p、miR-125b-5p、miR-183-5p在甲状腺癌的肿瘤较大、有复发、临床Ⅲ～Ⅳ期、血管间隙浸润、转移中均升高(P均<0.01)，见表3。

表2 2组血清相关miRNA表达水平比较

表3 相关miRNA在甲状腺癌患者中的变化特征 [例(%)]

2.4 诊断甲状腺癌ROC曲线分析 miR-221-3p+miR-125b-5p+miR-183-5p联合筛查方法AUC、约登指数、敏感度、特异度、准确度均高于miR-221-3p、miR-125b-5p、miR-183-5p单独筛查方法(P<0.05)；miR-221-3p、miR-125b-5p、miR-183-5p单独筛查方法AUC、约登指数、敏感度、特异度、准确度相近，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表4。

3 讨 论

甲状腺乳头状癌具有生物惰性，预后相对较好，然而，有10%～30%的甲状腺乳头状癌病例表现出进展性并导致预后不良。因此，确定其发展的分子机制对甲状腺乳头状癌的正确治疗至关重要。微小RNA(miRNA)是一类含有约22个核苷酸的内源性小RNA，其通过靶向3'非翻译区(3'UTR)上的序列来干扰蛋白质翻译过程。 通过负调节其靶基因的蛋白质表达水平，miRNA在肿瘤的发生、发展和进展中发挥重要作用，miRNA可能成为诊断、治疗甲状腺癌的潜在分子靶点。

图1 miR-221-3p、miR-125b-5p、miR-183-5p诊断甲状腺癌ROC曲线分析

miR-221-3p、miR-125b-5p、miR-183-5p是与肿瘤相关的miRNA，据报道在许多类型的癌症中发挥促进作用[10-12]。miR-221-3p、miR-125b-5p与miR-183-5p通过上调不同的致癌基因可在大多数类型的癌症中起肿瘤促进剂的作用。miR-221-3p可通过直接靶向SOX4促进上皮细胞向间充质细胞转化(EMT)过程而在前列腺癌进展中充当肿瘤促进因子[13]；miR-221-3p通过促进桩蛋白(PXN)的表达，作为肿瘤转移和胃癌侵袭的肿瘤促进因子发挥作用；miR-221-3p通过靶向SMAD2缩短细胞在G1/S期转变中的停滞并促进细胞增殖，以及宫颈癌细胞中的EMT迁移和侵袭[14]。最近的一项研究表明，miR-221-3p通过靶向hedgehog信号通路受体patched-1促进胰腺癌细胞的生长和侵袭。

表4 miR-221-3p、miR-125b-5p、miR-183-5p诊断甲状腺癌ROC曲线分析

注： 与miR-221-3p+miR-125b-5p+miR-183-5p比较,aP<0.05

miR-125b-5p的生物学功能与miR-221-3p相近。miR-125b-5p通过促进EGFR表达进而促进胶质瘤和乳腺癌细胞系的迁移和侵袭[15]。在胰腺癌和神经胶质瘤细胞系中，miR-125b-5p通过靶向MMP16促进迁移和侵袭，MMP16是一种对细胞外基质具有蛋白水解活性的蛋白酶。另一方面，miR-125b-5p的过表达显著增加了肝癌中的细胞迁移和侵袭性，其过表达与高风险和肝癌复发相关。miR-183-5p上调与透明细胞肾细胞癌、胃癌和肺癌的转移复发有关[16]。在胃癌中，高水平miR-183-5p可促进细胞周期蛋白D1和p27表达，而周期蛋白D1和p27是明确的致癌因子[17]。本次研究结果显示，与对照组比较，病例组miR-221-3p、miR-125b-5p、miR-183-5p表达水平明显升高。miR-221-3p、miR-125b-5p、miR-183-5p阳性率与肿瘤进展相关明显。这与上述讨论符合，说明miR-221-3p、miR-125b-5p与miR-183-5p在甲状腺癌中表达增加，且与甲状腺癌的进展密切相关。

miR-221-3p+miR-125b-5p+miR-183-5p联合筛查方法敏感度、特异度、准确度、AUC、约登指数均高于miR-221-3p、miR-125b-5p、miR-183-5p单独筛查方法。说明三者联合筛查甲状腺癌具有较高的价值。

综上，miR-221-3p、miR-125b-5p与miR-183-5p在甲状腺癌中表达增加，且与甲状腺癌的进展密切相关，miR-221-3p、miR-125b-5p、miR-183-5p可能为甲状腺癌的诊断、治疗靶点。miR-221-3p+miR-125b-5p+miR-183-5p联合筛查甲状腺癌具有较高的敏感度、特异度、准确度，适合临床推广应用。