T淋巴母细胞淋巴瘤/白血病患者PDL1蛋白/mRNA表达及其与临床病理参数和预后的关系

潘欢，陈晓燕，张婷，洪鸣

T淋巴母细胞淋巴瘤/白血病(T-LBL/ALL)是一种多见于儿童及青少年的血液疾病，是指不成熟前体T淋巴细胞经过转化而产生的具有高度增殖性的恶性肿瘤，早期局限于淋巴组织，随着病情恶化，T-LBL/ALL可逐渐扩散至骨髓[1-2]。报道显示[3-4]，T-LBL/ALL在儿童白血病中占比为12%～15%，虽然当前的标准化化疗方案可以使初治T-LBL/ALL患儿治愈率达到80%，但是对于部分高危患儿及多数成人患者，效果并不理想，寻找新的有效治疗方案十分迫切。随着对细胞免疫学的深入研究，程序性死亡配体1(PDL1)在肿瘤免疫治疗中的应用也越来越广。现分析PDL1蛋白/mRNA在T-LBL/ALL患者中的表达及其与临床病理参数和预后的关系，以期为PDL1应用于T-LBL/ALL的治疗提供依据，报道如下。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 标本收集： 选择 2016年1月—2018年12月江苏省人民医院血液内科三病区诊治T-LBL/ALL患者50例(T-LBL/ALL组)的存档病变组织蜡块，蜡块存档前患者均未接受过放化疗，患者均有完整临床资料，且获得3～36个月随访；另选择淋巴结反应性增生(LH)患者35例存档蜡块作为对照组。

1.1.2 仪器与试剂： DM20000显微镜、石蜡切片机和烤片机(德国LEICA)，PCR扩增仪和反转录仪(美国ABI公司生产)，Biophotometer核酸蛋白定量测定仪、兔抗人PDL1单克隆抗体(北京中山金桥公司生产)，FFPE标本总RNA提取试剂盒(中国厦门AmoyDx公司生产)。

1.2 病变组织芯片制作 (1)提取T-LBL/ALL、LH患者存档蜡块，常规4 μm切片，进行HE染色。由经验丰富的病理医师在显微镜下确认肿瘤最明显区域，并作标记，同时对标记切片对应蜡块中的相应肿瘤区予以标记。(2)制作石蜡模块，要求完成的石蜡模块各个孔完整性良好，且模块无裂痕。模块做好后，将已标记的T-LBL/ALL、LH组织蜡块按顺序标记，进行组织穿刺和填充，用采样针于标记区穿出组织条，并将组织条打入石蜡模块中，初步完成组织芯块。(3)将初步完成的组织芯块倒置于载玻片上，平移置于烤箱中，60℃环境中烘烤7～8 min，拿出并待其自然冷却，再放入60℃烤箱中烘烤7～8 min，循环5～6次，观察到石蜡模块与组织条基本融合后，标记组织芯块反面并保存。(4)将所获组织芯块置于切片机上连续4 μm切片，使用蒸馏水展片后平放置烤片机内，65℃环境中烘烤20 min，最终制得T-LBL/ALL、LH组织芯片蜡块。

1.3 观察指标与方法

1.3.1 PDL1蛋白表达检测：采用免疫组化法。将切好的T-LBL/ALL、LH组织芯片常规脱蜡水化后以PBS 液冲洗3次，5 min/次，高压蒸汽进行抗原修复，加入3%过氧化氢溶液，室温下孵育60 min，磷酸盐缓冲液(PBS液)冲洗后封闭，滴加相应的一抗50 μl至切片中，阴性对照组用PBS液代替一抗，静置60 min。PBS液冲洗(3次，5 min/次)，滴加生物素标记的二抗50 μl，静置10 min。PBS液冲洗3次，5min/次，之后滴加DAB显色剂，显微镜下观察控制染色强度，苏木素复染后自来水冲洗，二甲苯透明，中性树胶封固。由2位专业医师分析结果，意见一致则为判断有效，若不一致则请第3位医师评价。PDL1主要在细胞膜中表达，细胞膜颜色为棕黄色判断为阳性，阳性细胞百分率：0分，无染色；1分，阳性细胞百分率<5%；2分，阳性细胞百分率5%～9%；3分，阳性细胞百分率≥10%。0～1分为阴性，2～3分为阳性。

1.3.2 PDL1 mRNA表达检测：采用实时荧光定量PCR检测。将切好的T-LBL/ALL、LH组织芯片常规脱蜡水化后采用蒸馏水进行冲洗，刮片，根据试剂盒说明书提取RNA。依照逆转录试剂盒说明书配置预混液，单份体积为18 μl，加入模板RNA 2 μl，充分混匀后离心，获取cDNA，置于4℃环境中保存。将引物配置成工作液后，再配置PCR扩增预混液，于PCR 扩增仪上扩增，反应条件：95℃环境下预变性20 s，再进行3 s循环变性40次，60℃环境下退火/延伸30 s，绘制溶解曲线。重复3次，得到对应CT值，取平均数。PDL1的mRNA表达水平以相对表达量来表示，以各组内基因表达量最低样本为校准，ΔCT=目的基因CT-内参CT，相对表达量为2-(样本ΔCT-组内基因表达量最低样本ΔCT)。

1.3.3 临床资料收集：收集T-LBL/ALL组患者临床资料，包括性别、年龄、Ann Arbor分期、有无肝脾肿大、有无骨髓侵犯、有无B症状(无其他因素而发生体温>38℃且持续时间>3 d，半年内体质量下降>10%，伴盗汗症状)、国际预后指数(IPI)(用于评估侵袭性淋巴瘤预后的指标，包括年龄、功能状态、疾病分期、结外浸润和血清乳酸脱氢酶水平等5个因素)、体力状况ECOG评分。

2 结 果

2.1 2组PDL1蛋白及其mRNA表达比较 T-LBL/ALL组PDL1蛋白表达阳性率高于LH组(P<0.01)，PDL1 mRNA表达量高于LH组(P<0.01)，见表1。

表1 2组PDL1蛋白及其mRNA表达比较

2.2 PDL1表达与临床病理参数的关系 T-LBL/ALL患者PDL1蛋白阳性、PDL1 mRNA表达量均与骨髓侵犯及IPI评分有关，其中有骨髓侵犯、IPI评分>2分的T-LBL/ALL患者PDL1蛋白表达阳性率、PDL1 mRNA表达量均明显较高(P<0.05)，见表2。

2.3 PDL1表达与T-LBL/ALL患者预后的关系 Kaplan-Meier生存分析显示，PDL1蛋白表达阳性者中位总生存时间(16.28个月)短于PDL1蛋白表达阴性者(19.21个月)(log-rank=9.761，P=0.002)。 PDL1 mRNA表达量与T-LBL/ALL总生存时间呈负相关(r=-0.718，P=0.000)。

3 讨 论

T-LBL/ALL是一种恶性程度高的血液系统肿瘤，多见于男性，患者可出现浅表淋巴结肿大，并伴有纵隔肿块及胸水，病情发展迅速且预后较差[5-6]。当前临床治疗以化疗为主，虽然T-LBL/ALL患者总体生存率较以往有所提升，生存周期延长，但仍存在肿瘤复发、化疗失败等情况，且复发患者预后极差，故而寻找和T-LBL/ALL靶向治疗及预后的相关指标具有重要价值。

研究显示，T-LBL/ALL肿瘤细胞处于具有高度免疫抑制的微环境中，该环境中多种成分与肿瘤细胞不断接触，促使肿瘤细胞逃避自身免疫反应，不断生长及增殖，具体机制可能与免疫抑制性细胞因子及介导负性共刺激信号有关[7-8]。PD1/PDL1为当前重要成熟免疫检测点通路，PDL1是PD1重要配体，为B7家族跨膜分子，在造血细胞及肿瘤细胞表面含量较多，可抑制T淋巴细胞，并诱导免疫耐受，其与PDL1结合后，会增强T细胞线粒体内氧化反应，使得活性氧和过氧化氢水平升高，继而抑制T细胞增殖，诱导其凋亡，削弱机体对肿瘤细胞的免疫应答，诱导免疫逃逸，在肿瘤发生及发展中起到重要作用[9-11]。研究指出[12-15]，乳腺癌、肺癌、胃癌等中PDL1均可呈现高表达，且与肿瘤大小、淋巴结转移、病理分级等相关。对肿瘤患者采用抗PD1/PDL1抗体类药物，能够有效抑制PD1/PDL1通路激活，增强机体对肿瘤细胞的免疫应答作用，阻断肿瘤细胞免疫逃逸，恢复细胞毒性T淋巴细胞特异性杀伤功能，使患者自身免疫系统激活，杀死肿瘤细胞。Bertucci等[16]研究指出，对于侵袭性乳腺癌，可将PD1/PDL1作为其治疗靶标，以延缓肿瘤复发，改善患者生存质量。当前国内对PDL1与T-LBL/ALL的相关研究较少，本研究分析PDL1在T-LBL/ALL患者中的表达情况，并以LH患者作为对照，显示T-LBL/ALL组PDL1蛋白表达阳性率和 mRNA表达量均高于LH组，提示PDL1在T-LBL/ALL患者中呈高表达。Ansell等[17]研究亦表明，众多淋巴细胞瘤均检测到PDL1呈高表达，其表达水平可作为淋巴瘤患者预后指标。李义等[18]研究指出，淋巴瘤PDL1的高表达与肿瘤侵袭性具有关联性，广泛PDL1高表达可增强肿瘤增殖及侵袭特性。本研究分析PDL1蛋白及其mRNA表达量与临床病理参数及预后的关系，显示有骨髓侵犯IPI评分>2分的T-LBL/ALL患者PDL1蛋白表达阳性率和PDL1 mRNA表达量明显较高，PDL1蛋白表达阳性患者总生存时间短于PDL1蛋白表达阴性患者，而PDL1 mRNA表达量与T-LBL/ALL总生存时间呈负相关，提示PDL1可能参与T-LBL/ALL的发生及发展，PDL1蛋白表达阳性和PDL1 mRNA表达量较高的患者预后更差。分析其作用机制，猜测可能是PDL1抑制T淋巴细胞增殖生长，并参与了不成熟前体T淋巴细胞发生异常转化而产生恶性生物学行为的过程，且PDL1表达越显著，肿瘤恶性程度越明显。但关于其具体作用过程，因本次研究条件有限，未予以进一步探讨，还需在后期研究中深入探讨。

表2 50例T-LBL/ALL患者PDL1表达与临床病理参数的关系

综上，PDL1蛋白及其mRNA在T-LBL/ALL患者中均呈高表达，可能与T-LBL/ALL发生及发展有关，对T-LBL/ALL进展和预后评估具有重要作用，可考虑将PDL1蛋白及其mRNA作为T-LBL/ALL治疗评价的重要切入点。