溶血对脑脊液蛋白检测的干扰研究

余晓慧 ，刘静 ，邬艳 ，陈晶

（1.瑞昌市人民医院，江西 九江 332200；2.南昌大学第二附属医院，江西 南昌 330006；3.南昌市东湖区疾病预防控制中心，江西 南昌 330006；4.南昌大学医学院，江西 南昌 330006）

脑脊液（CSF）是存在于脑室和蛛网膜下腔的一种无色透明液体，对脑和脊髓具有保护、支持和营养等多种功能[1]。正常CSF中存在着蛋白质、葡萄糖、氯化物和酶类等化学物质，各类成分含量保持相对稳定,以保证CSF发挥正常的生理功能[2]。经典的CSF蛋白质包括总蛋白 （TP）和微量蛋白（mALB），TP常用于辅助诊断中枢神经系统炎症、神经根病变及椎管内梗阻性脑病,也常用于鉴别细菌性与非细菌性感染[3]，而mALB主要经血脑屏障渗透而来，被认为是评价血脑屏障完整性的理想参数[4]，因此CSF中TP和mALB的准确检测有重要临床价值[5]。但在检验工作中，我们发现有部分CSF标本由于蛛网膜下腔出血或穿刺导致黄变（轻微溶血）或溶血现象，由于CSF标本不易获取，检验科往往会做让步检验,但溶血对CSF标本中的蛋白成分检测的影响如何,尚未见相关报道。本研究中,我们依据中华人民共和国卫生行业标准WS/T 416-2013《干扰实验指南》对溶血干扰CSF蛋白的检测进行干扰研究，探讨不同溶血程度对CSF蛋白检测结果的影响，为检验人员更好地了解检验结果，为临床提供更准确的解释提供实验依据，也为其他CSF检测项目的干扰研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 研究对象 选择TP和mALB浓度分别接近正常生物参考区间上限的CSF标本各1例,外观清亮，经Sysmex全自动血细胞分析仪检测CSF标本中血红蛋白（Hb）含量为0g/L，此为基础样品。同时收集同一病人的血常规标本备用。

1.1.2 主要仪器和试剂 Beckman AU5400全自动生化分析仪，CSF-TP检测试剂盒为中山标佳生物科技有限公司的尿液总蛋白检测试剂盒,方法为邻苯三酚红钼（PRM）比色法；CSF-mALB检测试剂盒为DiaSys公司微量白蛋白测定试剂盒,方法为免疫透射比浊法,两者均使用配套校准品和质控品。Sysmex XE-2100全自动血细胞分析仪，使用原装配套试剂和质控品。

1.2 实验方法

1.2.1 干扰物（溶血）原液的制备 取上述血常规标本2ml，3000g离心3min，小心吸出上层血浆弃去，剩下约1ml红细胞转移到干净试管中,加入5ml生理盐水轻轻颠倒混匀,充分洗涤红细胞,3000g离心3min,小心吸出上层液体弃去，继续将红细胞以同样的方法清洗5次,对最后一次上清液进行TP和mALB浓度检测,直到其浓度<0.1mg/L为止,如不合格则继续进行清洗直到合格为止。清洗结束后，加入200μl蒸馏水混匀制得红细胞悬液，以注射器反复吹打彻底溶解红细胞，3000g离心3min吸取上层溶血液体即为干扰物原液，以Sysmex XE-2100全自动血细胞分析仪检测Hb浓度并记录。此处需注意溶解红细胞要彻底才能获得高Hb浓度的干扰物原液。

1.2.2 干扰物剂量效应评价实验

1.2.2.1 干扰物高实验浓度样品与低实验浓度样品制备 见表1。

表1 实验样品制备方法

1.2.2.2 实验样品系列的制备 将上述制得的干扰物高实验浓度样品与低实验浓度样品定量混合，可得到干扰物浓度介于两样品之间的一系列实验样品。确定线性剂量相关关系时需要5个浓度水平。见表2。

表2 干扰物不同浓度系列样品的制备

1.2.2.3 TP和mALB测定 用Beckman AU5400全自动生化分析仪检测上述样品中TP和mALB浓度，仪器质控在控状态下进行实验。所有样品一次检测完成，所有操作均严格按照实验室操作规程进行。每个样品重复检测3次，将上述系列样品按升序（1、2、3、4、5）进行第一次检测，再按降序（5、4、3、2、1）进行第二次检测，再按升序进行第三次检测。记录结果。

1.3 数据处理与分析 计算最低干扰物浓度样品的测定均值，分别用5个水平样品的测定均值减去此均值得出不同浓度干扰物的干扰效果。以干扰效果为Y值，干扰物浓度为X值，绘出干扰物剂量相关曲线。根据曲线趋势进行数据分析。如果为线性相关，则计算线性回归方程；如果为非线性相关，则采用非线性回归分析得出相应的最佳拟合曲线与数学模型。根据回归方程或数学模型可推断出在评价范围内任意干扰物浓度所引起的干扰效应值。

2 结果

2.1 干扰物（溶血）原液中Hb浓度 本次实验选取了2名患者的CSF标本，分别用于研究溶血对CSF中TP和mALB的干扰效应。以Hb浓度来表示标本的溶血程度，标本中Hb浓度越高则表示标本溶血越明显。用此2位病人的血常规标本分别制作了干扰物（溶血）原液，TP的干扰物原液中Hb浓度为201g/L，mALB的干扰物原液中Hb浓度为175g/L。

2.2 干扰效果 用Beckman AU5400全自动生化分析仪检测实验样品系列,结果见表3和表4。

表3 CSF-TP干扰物浓度及干扰效果

表4 CSF-mALB干扰物浓度及干扰效果

2.3 干扰效果的回归分析 以干扰效果为Y值，干扰物浓度为X值，绘出干扰物剂量相关曲线。溶血程度与CSF中TP检测的干扰效果为线性相关、正向干扰，溶血程度越高,干扰越明显,对mALB的干扰效果不明显,溶血程度与干扰效果之间无相关性,见图 1、图 2。

图1 溶血对CSF中TP检测的干扰效果

图2 溶血对CSF中mALB检测的干扰效果

3 讨论

近年来随着检验技术的快速发展,大部分检验项目实现了自动化，检验过程实现了精准控制，这大大提高了检验结果的准确性。也正是因为如此，检验前因素如标本溶血、脂浊和黄疸等对检验结果的干扰也越来越凸显,因此,充分研究并了解检验前因素对检验的干扰作用有助于检验人员对结果做出正确的判断,并为临床提供可靠的诊断依据[6]。

标本溶血是检验前干扰因素中最常见的一种[7,8]，其影响检测结果的机制主要有三方面：⑴红细胞内的高浓度物质如K、LDH、AST等随溶血进入待检标本后，使相应物质的浓度增加；⑵血红蛋白本身吸光度的干扰;⑶某些红细胞成分对化学反应的干扰[9]。PRM比色法检测CSF-TP的原理为邻苯三酚红与钼酸盐结合形成红色复合物,在酸性条件下，该复合物与总蛋白结合，从而使蛋白的最大吸收波长由467nm转换为598nm,并产生蓝紫色,仪器根据吸光度的变化计算CSF-TP的含量[10]。Hb在体内除原始形态外,还存在氧合血红蛋白和高铁血红蛋白等形式,吸收光谱覆盖540nm～630nm[11-13]，造成PRM比色法在598nm处的吸光度增加，进而错误地表现为待测物浓度增加,而在本研究中则表现为溶血对CSF-TP检测的正干扰,且干扰幅度极大，每克Hb的干扰效果远超卫健委推荐的允许总误差10%，因此溶血标本不适合进行CSF-TP的检测。应用免疫透射比浊法检测CSF-mALB的原理是羊抗人白蛋白抗体和样品中的白蛋白进行抗原抗体反应，待反应完成后，用透射比浊检测吸光度的变化反映白蛋白的浓度。本文结果显示，低浓度的Hb对免疫透射比浊法检测CSF-mALB基本无干扰,这与试剂说明书所宣称的一致（Hb≤2.5g/L时无干扰），也与此前的文献报道相一致[14]，当Hb浓度＞4g/L时,本结果显示其干扰效果也不明显，但仍有待其他研究的进一步验证。该反应使用的检测波长为415nm，而且抗原抗体的反应相对特异性高，可能是mALB检测受Hb影响小的主要原因,因此临床上对于有溶血的CSF标本可以进行mALB的检测。

临床上针对溶血标本的处理有多种方法，如增加副波长检测、Hb单克隆抗体、统计学消除等，但这都是标本采集后处理，不仅操作繁琐，而且有些干扰是不可消除的[15]。对此，检验工作人员应了解溶血对检测项目的干扰作用,为临床提供正确的解读，同时也应积极与医护沟通，着重培训正确的采样程序，从源头减少溶血标本的产生，这样才能切实提高实验室水平，保证检验质量。