维生素D水平及其受体基因的多态性与女童中枢性性早熟关系的研究

钟龙青 ，刘志强 ，杨利 ，刘发娣 ，柯江维

(江西省儿童医院检验科，江西 南昌 330006)

维生素D(Vit D)又称为骨化醇、抗佝偻病维生 素，是不同的Vit D原经紫线外照射后形成的脂溶性固醇类衍生物,也是一种类固醇激素[1],并由细胞内特异的Vit D受体(VDR)介导，发挥激素样的生理特性。维生素D受体是介导有生物活性的维生素D发挥生物效应的核内生物大分子，属于类固醇激素受体，其功能反映了活性维生素D的功能[2,3]。同时，研究发现 VDR 基因 ApaI， TaqI， BsmI和FokI的多态性与很多疾病的发生发展有着密切的关联[4-6]。

Vit D与性激素（主要指雌二醇）同属于类固醇激素，两者之间是否具有交叉的生物学效应。目前尚无文献报道。国外已有少数的文献研究表明，VDR介导的Vit D信号途径参与了儿童性腺的发育，Vit D水平及VDR基因可能与儿童性激素的分泌及性早熟有着密切的关联，但没有Vit D水平及VDR基因多态性与儿童性早熟相关性的研究。因此，本文将研究中枢性性早熟女童Vit D浓度变化及VDR基因多态性差异，以了解维生素D影响女童性早熟的部分机制。

1 材料和方法

1.1 研究对象及标本采集 选取2016年7月-201 6年9月期间在我院内分泌科住院或门诊就诊的临床症状符合且经B超，骨龄摄片，CT，MRI及GnRHa激发试验确认为中枢性性早熟[7]，并排外其他疾病的40例省内女童为病例组，年龄为7.90±0.67岁，并选取同期在我院儿保科进行体检且身体健康的女童作为对照组，年龄为7.86±1.25岁。

1.2 实验方法

1.2.1 标本采集 留取病例组与对照组患儿外周血4ml,其中2ml置于含乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中，另外2ml置于普通管中，立即送检，用化学发光技术检测其血清25-OH Vit D的浓度。

1.2.2 外周血基因组DNA提取 将置于EDTA抗凝管中的2ml血,采用TIANGEN试剂盒提取DNA，-80℃保存备用。

1.2.3 引物设计与合成 委托上海生工生物工程技术有限公司合设计合成。

1.2.4 rs2228570，rs7975232，rs1544410，rs731236目的基因的扩增和多态性位点测序 先采用多重PCR进行扩增,之后进行SNaPshot多重单碱基延伸反应并将延伸产物纯化后在ABI3730XL测序仪上测序,采用GeneMapper 4.1(AppliedBiosystems)进行分析。

1.3 统计学分析 用spss17.0进行统计学分析,基因型和等位基因频率采用基因计数法计数,研究对象与Hardy-Weinberg平衡的符合程度、单个基因型及组间等位基因频率比较采用四方格χ2检验,计量资料维生素D进行正态性检验，其呈偏态分布,采用秩和检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病例基本资料 该实验纳入中枢性性早熟女童40例，年龄(7.90±0.67)岁，正常健康女童40例，年龄(7.86±1.25)岁,两组年龄无统计学差异(t=0.190，P=0.85)。

2.2 病例组和对照组血清中VitD测定 中枢性早熟患儿25-OH Vit D水平为 45.51(35.06，54.24)nmol/L,健康儿童25-OH Vit D水平为60.25(52.19，72.95)nmol/L，将其进行秩和检验发现两组的差异有统计学意义(P<0.001)，见表1。

表1 中枢性性早熟和健康对照组25-OH Vit D水平

2.3 中枢性早熟患儿的发育年龄与血清中维生素D的水平进行相关性分析 发现中枢性早熟患儿的发育年龄与血清中维生素D的水平两者之间无线性关系（P=0.561）。

2.4 中枢性性早熟和健康对照组25-OH Vit D各水平构成比 40例中枢性性早熟患儿中，有13例(32.5%)出现维生素D缺乏，13例(32.5%)出现维生素 D 不足(25-OH Vit D<50 nmol/L)，14例（35%）的维生素D水平正常。在健康对照组中,维生素D不足者有7例（17.5%），33例（82.5%）维生素D水平正常。维生素D不足的女童患中枢性性早熟的风险明显提高（OR=8.755，95%可信区间为3.086~24.838）。 见表 2。

表2 中枢性性早熟和健康对照组25-OH Vit D各水平构成比

2.5 VDR基因多态性位点测序结果 将所提取的DNA送至上海生工生物工程技术有限公司用ABI 3730XL型测序仪进行SnapShot测序。测序所得VDR基因在两组人群中的分布频率,经Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验,达到遗传平衡,具有群体代表性。

2.6 两组间VDR基因多态性的比较 基因序列rs1544410(BsmI)的野生型为 CC，突变型为 CT、TT，中枢性性早熟组与正常对照组均未检测到TT，基因型CC、CT在两组中的分布差异无统计学意义(χ2=0.721，P=0.396)。 两组基因型 CC和 CT的 OR和95%可信区间(CI)分别为1.056(0.931-1.197)和0.500(0.097-2.577)。基因序列rs2228570(FokI)的野生型为AA，突变型为GA、GG，此三种基因型在中枢性性早熟和正常对照组的分布差异无统计学意义(χ2=3.414，P=0.181)，等位基因 A、G 在两组的分布差异也无统计学意义(χ2=2.633，P=0.105)。 基因序列rs731236(TaqI)的野生型为AA，突变型为GA、GG，两组均未检测到GG，基因型AA、GA在两组中的分布差异无统计学意义(χ2=0.000,P=1.000)。基因序列rs7975232(ApaI)的野生型为CC，突变型为CA、AA，三种基因型在两组的分布差异有统计学意义(χ2=9.833，P=0.007)。 等位基因 C、A 在两组间的分布差异无统计学意义 (χ2=2.795，P=0.095)。见表3。

表3 中枢性性早熟组和对照组VDR基因多态性的比较

3 讨论

性早熟是一种儿童生长发育异常的疾病，与儿童的正常生长发育周期相违背,影响儿童的身心健康并引起一系列社会经济问题[8,9]。性早熟的发病机制错综复杂,是基因和环境共同影响作用的结果。自2008年,维生素D缺乏或不足引起公共卫生问题[10]被提出，维生素D逐渐成为人们研究的热点。有研究表明维生素D可能与性早熟的发病有关。

目前有关维生素D与性早熟相关性的研究较少。国内唐家彦[11]等研究表明性早熟女童维生素D水平明显低于对照组女童。国外Hae Sang Lee[12]等研究表明性早熟女童中,维生素D缺乏者的比例明显高于正常女童。本文对40例性早熟女童和40例健康女童进行研究发现,中枢性性早熟女童维生素D水平低于健康女童,其维生素D不足者所占比例明显高于正常对照组女童。中枢性性早熟女童中维生素D水平与其发育年龄进行相关性研究,发现两者间无相关性，与国内外之前研究相符。

众所周知，25-OH VitD必须通过与VDR结合才能发挥生物学效应。同时有研究表明维生素D代谢过程中所需的酶受VDR基因多态性的调节[13,14]。新近的研究表明：VDR的功能受VDR基因SNP的影响，且与多种疾病相关，在VDR众多SNP位点中，研究较多的是 ApaI(rs7975232)、BsmI(rs1544410)、TaqI（rs731236）、FokI(rs2228570)。

目前有关VDR基因多态性与性早熟的研究也较少，国外学者Santos BR[15]2012年对36名性早熟儿童进行研究发现，VDR的ApaI多态性位点可以调节人体内雌激素的分泌与性早熟的发生有关，具体作用机制没有阐明。本文采用SnaPshot方法对VDR的SNP位点，包括ApaI(rs7975232)、BsmI(rs1544410)、TaqI（rs731236）、FokI(rs2228570)进行检测分析。实验中发现中枢性性早熟组以及健康对照组的 BsmI(rs1544410)和 TaqI（rs731236）位点仅能检测到野生型与杂合型两种基因型,分别为CC、CT和AA、GA。中枢性性早熟组的基因型以及分布频率分别为 CC(95%)、CT(5%)和 AA(90%)、GA(10%)，对照组的为 CC(90%)、CT(10%)和 AA(90%)、GA(10%)，各基因型在两组的分布差异无统计学意义（χ2=0.721，P=0.396；χ2=0，P=1）。 等位基因 C、T和G、A在两组中分布的差异也无统计学意义（χ2=0.693，P=0.405；Xχ2=0，P=1）， 提示这两位点的多态性可能与性早熟的发病无关。FokI(rs2228570)位点在两组中均存在三种基因型，中枢性性早熟组的基因型以及分布频率分别为AA(12.5%)、GA(40%)、 GG(47.5%)， 对照组为 AA(17.5%)、 GA(55%)、GG(27.5%)，三种基因型在两组的分布差异无统计学意义（χ2=3.414，P=0.181）。 对 G、A 两等位基因进行分析，发现其在两组的分布差异也无统计学意义（χ2=2.633，P=0.105）。提示多态性位点FokI可能与性早熟的发病无关。对于ApaI(rs7975 232)位点,两组中均发现三种基因型 CC，CA，AA,其分布频率分别为25%,70%,5%和55%,35%,10%,在两组间的分布差异有统计学意义 （χ2=9.833，P=0.007）。这说明VDR的ApaI位点的多态性存在可能影响了性早熟的易感性。

综上所述，我们推测ApaI(rs7975232)位点的突变可能影响了VDR基因mRNA3’末端非翻译区，该区通过调控VDR蛋白质的合成，影响VDR蛋白的表达，从而影响患儿对性早熟的易感性。结合前期研究发现维生素D水平影响性早熟的发病率，而维生素D的生物活性作用需要VDR介导，推测可能维生素D是通过影响VDR的ApaI位点的多态性起作用的。其作用机制值得进一步研究。