黄芪水溶多糖的提取及抗氧化活性研究

郑丹 谢丹丹 张丽霞

摘    要：为提高黄芪水溶多糖的提取率，本研究通过单因素试验和正交试验相结合，对水提醇沉法提取黄芪水溶性多糖的工艺（料液比、提取温度、提取时间）进行优化，其优化工艺为料液比1∶15、提取温度90 ℃、提取时间80 min，此条件下黄芪水溶粗多糖提取率为18.60%，纯化多糖（糖含量65.23%）提取率为11.21%。为研究所提取的黄芪水溶多糖的抗氧化活性，以Vc作为对照，开展羟基自由基（·OH）和超氧阴离子自由基（·O2-）清除试验，结果表明，水溶粗多糖、纯化多糖和Vc对·OH清除率在0.2～1.2 mg·mL-1范围内、对·O2-的清除率在0.5～3.0 mg·mL-1范围内，均随浓度增加呈先升高后降低的趋势，三者对·OH清除率最大值分别为75.61%（0.8 mg·mL-1），88.49%（1.0 mg·mL-1）和64.47%（1.0 mg·mL-1），对·O2-的清除率最大值分别为74.29%（2.0 mg·mL-1），69.30%（2.5 mg·mL-1）和94.42%（2.0 mg·mL-1），处理间差异均显著（P<0.05）。由此可见，水提醇沉法提取黄芪水溶性多糖方法可行，且其在抗氧化活性的应用方面具有较大的潜力。

关键词：黄芪;水溶多糖;水提醇沉法;抗氧化活性

中圖分类号：R284.1          文献标识码：A           DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.11.003

Abstract：In order to improve the extraction rate of water-soluble polysaccharide from Astragalus membranaceus， The experiment was conducted with single factor test and orthogonal test to optimize the material liquid ratio， extraction temperature， and extraction time of water-soluble polysaccharide extraction technology from A. membranaceus by water extraction and alcohol precipitation. The optimized process was as follows： ratio of material to liquid was 1∶15， extraction temperature was 90 ℃ and extraction time was 80 min， which the extraction rate of A. membranaceus polysaccharide was 18.60%， and the extraction rate of purified polysaccharide （sugar content 65.23%） was 11.21%. In order to study the antioxidant activity of water-soluble polysaccharide of A. membranaceus， the scavenging experiments of hydroxyl radicals （·OH） and superoxide anion radicals （·O2-） were carried out， Vc was as the control. The results showed that the scavenging rate of water-soluble crude polysaccharide， purified polysaccharide and Vc to ·OH in the range of 0.2～1.2 mg·mL-1 and to ·O2- in the range of 0.5～3.0 mg·mL-1 increased first and then decreased with the increase of concentration. The maximum scavenging rate of the three to ·OH was 75.61% （0.8 mg·mL-1）， 88.49% （1.0 mg·mL-1） and 64.47% （1.0 mg·mL-1）， respectively， while the maximum scavenging rate to ·O2- were 74.29%（2.0 mg·mL-1）， 69.30% （2.5 mg·mL-1） and 94.42% （2.0 mg·mL-1）， respectively， which there were significant differences between treatments（P<0.05）. Therefore， the method of water extraction and alcohol precipitation is feasible to extract water-soluble polysaccharide from A. membranaceus， and it has great potential in the application of antioxidant activity.

Key words： Astragalus membranaceus; water-soluble polysaccharides; water extraction and alcohol precipitation; antioxidant activity

黄芪（Astragalus membranaceus）为豆科黄芪属多年生草本植物，是常见药用植物之一[1]，其药用部分为根部，具有益气、止汗、利尿除湿、活血消肿以及生肌等功效[2]。多糖是黄芪药用部分的主要活性物质之一，具有抗氧化、降血糖、抗肿瘤、抗衰老等功能[3-13]。多糖按酸碱性分为：酸性多糖、碱性多糖、中性多糖;按溶解性分为水溶性多糖、水不溶性多糖[14]。其中，水溶性多糖由葡萄糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖组成[15]，具有止汗、抗肿瘤等免疫功能[2]。有关水溶性多糖的研究已在黄芪、芦荟、人参、南瓜玉米、高山红景天等植物中有诸多报道[16-17]，但传统的溶剂萃取法有提取时间长、温度高、提取率低等缺点。因此，本文采用水提醇沉法提取黄芪水溶性多糖，对自由基进行清除试验，探究其抗氧化活性。

本文通过优化黄芪水溶多糖的提取工艺获得高提取率的较纯的水溶性多糖，并对其清除·OH和·O2-能力即抗氧化活性[18-19]进行研究，旨在为其在医药等领域的应用提供参考。

1 材料和方法

1.1 材 料

试验用黄芪为市售，购于黑龙江省大庆市让胡路区普济康复医院，烘干至恒质量后研磨成粉备用。

试验用无水乙醇、氢氧化钠、葡萄糖、苯酚、浓硫酸、三氯乙酸、浓氨水、双氧水、溴化钾、硫酸亚铁、水杨酸、Tris-盐酸、邻苯三酚等均为化学纯。

试验用仪器主要包括电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9245A）、电热恒温水浴锅（HHS）、离心机（PDZ5-WS）、紫外可见分光光度计（752N）和恒流泵（BT1-100E）。

1.2 方 法

1.2.1 黄芪水溶多糖的提取工艺优化  （1）采用水提醇沉法[20]提取黄芪中的水溶性多糖，即按一定料液比在烧杯中加入黄芪粉末和纯净水，水浴加热提取一定时间，1/3体积75%乙醇沉降多糖，去除蛋白、色素、阴阳离子，再次1/3体积75%醇沉（共两次，目的是除去多余的水分），离心后干燥，即为粗多糖。试验开展了不同料液比、提取温度和提取时间对多糖提取率影响的单因素试验，再通过正交试验（表1）优化上述工艺条件，以提升黄芪水溶多糖提取率。

（2）利用苯酚硫酸法[20-21]测定黄芪水溶粗多糖含量并进行多糖提取率计算。

具体操作：准确称取105 ℃烘干至恒质量的标准葡萄糖50 mg，以蒸馏水定容至500 mL容量瓶中并摇匀，分别取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9和1.0 mL葡萄糖标准溶液，分别加蒸馏水补至1.0 mL，加5%苯酚溶液2.5 mL混匀，迅速加入5.0 mL浓硫酸混匀，沸水浴15 min，在490 nm处测定吸光度。以葡萄糖质量浓度（x）为横坐标、吸光度（ A）为纵坐标绘制标准曲线（图1）。按照文献[22]，得回归方程A=1.2×10-2C-9×10-3，式中，A为吸光度，C为葡糖糖浓度;方程R2=0.999 8，回归拟合效果良好。以提取出的黄芪水溶粗多糖或纯化多糖替换葡萄糖标准溶液进行上述试验，测定490 nm的吸光度，重复3次，根据回归方程计算多糖或纯化多糖含量，则多糖提取率=多糖含量/原料质量×100%。

1.2.2 黄芪水溶多糖纯化 （1）脱蛋白。取上述粗多糖配成5%的糖溶液，加入等體积的30%三氯乙酸摇匀，置于 4 ℃冰箱，醇沉过夜，然后离心，留上清，再用1 mol·L-1 NaOH溶液中和至pH值=7即可。

（2）脱色素。将脱蛋白后的多糖溶液，用浓氨水调至pH值=8.0，逐渐滴加20% H2O2至溶液为浅黄色，50 ℃水浴，保温2 h后过滤。

（3）柱层析。将脱色素后的多糖溶液浓缩至5 mL，采用DEAE-纤维素和琼脂糖凝胶Sepharose CL-6B柱层析相结合的方法对水溶粗多糖进行进一步纯化分离，得到纯化的黄芪水溶多糖。

（4）多糖结构检测。取黄芪水溶粗多糖和纯化多糖粉末各2 mg与干燥的KBr在玛瑙研钵中研磨均匀后压片，使用傅立叶红外光谱仪在4 000～400 cm-1范围内进行扫描，检测多糖结构。

1.2.3 抗氧化活性测定 （1）羟基自由基（·OH）清除试验-Smirnoff法[23]。利用H2O2与Fe2+混合产生·OH，在体系里加入水杨酸以捕捉·OH并产生有色物质，该有色物质在510 nm处有最大吸收。将黄芪粗多糖、纯化多糖和Vc（对照）用蒸馏水进行稀释，分别配成一系列浓度梯度的溶液，即0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mg·mL-1。将1 mL 9 moL·L-1FeSO4 溶液和2 mL 9 moL·L-1水杨酸-乙醇溶液加入试管，再分别加入不同质量浓度的黄芪粗多糖、纯化多糖和Vc溶液各2 mL，最后加入2 mL 8.8 moL·L-1H2O2，在37 ℃温度条件下反应30 min，每个处理3个重复。以蒸馏水代替粗多糖作空白调零，在波长510 nm 处测定各处理的吸光度。自由基的清除率的计算公式：

·OH清除率=（A0-Ax）/A0×100%

式中，A0为空白对照液的吸光度，Ax为加入多糖液的吸光度。

（2）超氧阴离子自由基（·O2-）清除试验—邻苯三酚自氧化法[23]。取25 ℃水浴中预热的0.05 mol·L-1Tris-HCl（pH值=8.2），分别加入不同浓度（0.5，1.0，1.5，2.0，

2.5，3.0 mg·mL-1）水溶粗多糖、纯化多糖、Vc（对照）溶液1 mL，再加入25 mmoL·L-1的邻苯三酚溶液4 mL，迅速摇匀，并立刻于波长325 nm处每隔30 s测一次吸光值，反应时间为3 min，每个处理3个重复。·O2-清除率的计算公式为：

丁利君和吴倩萍[18]、李宝霞等[19]研究表明，黄芪多糖具有一定的抗氧化活性，前者认为黄芪多糖对羟自由基（·OH）和超氧自由基（·O2-）的清除率分别在0～1.0 mL和0～3.0 mL范围内与多糖溶液加入量正相关，后者认为在0.05～ 0.25 mg·mL-1范围内，黄芪多糖对·OH的抑制率与浓度正相关，同时其对·OH清除能力高于公认的抗氧化剂Vc。本研究中，无论是黄芪水溶粗多糖、纯化多糖还是Vc对·OH和·O2-的清除率分别在0.2～1.2 mg·mL-1和0.5～3.0 mg·mL-1范围内均随浓度增加呈先升高后降低的抛物线趋势，这与丁利君和吴倩萍[18]的研究结果不同，可能是由于所提取多糖中的具有抗氧化活性的糖含量不同及所采用的剂量单位所致，而与李宝霞等[19]相比较，本研究的多糖及Vc范围包含了李宝霞等[19]研究中所设的浓度范围（0.05～ 0.25 mg·mL-1），且在此范围内本研究中多糖和Vc对·OH的清除率亦呈增加趋势。

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