GeneXpert MTB/RIF快速检测在肺结核患者诊断中的应用价值

钟 莉，许 铠

(云南省红河州第一人民医院检验科，云南蒙自 661199)

我国是全球范围内的22个肺结核高负担国家之一，每年肺结核发病率居第3位[1]，肺结核患者的早诊断对预防肺结核传播及提高治疗效果有积极意义，传统的细菌学诊断方法包括痰涂片显微镜检查、结核分枝杆菌(MTB)固体培养。涂片抗酸染色显微镜检查至少需要每毫升含10 000个抗酸菌的标本才能检出，灵敏度低，并且不能区分MTB和非MTB；MTB固体培养方法耗时长，不能有效满足早诊断、早治疗的要求。2010年WHO推荐Xpert MTB/RIF系统用于结核病的快速诊断和MTB对利福平的耐药性检测[2]，这种检测方法灵敏度高，可以准确、快速地检测出利福平耐药基因(ropB突变基因)，成为结核病检查的重要方法之一。本研究对肺结核患者和疑似肺结核患者的标本采用了Xpert MTB/RIF快速检测、抗酸染色、全血γ-干扰素释放试验、血清结核杆菌IgG检测，旨在评价Xpert MTB/RIF快速检测的应用价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 将2016年9月至2018年12月在本院就诊并住院的肺结核和疑似肺结核患者共106例纳入研究，上述人群均送检了Xpert MTB/RIF、抗酸染色、全血γ-干扰素释放试验、血清结核杆菌IgG检测4个检测项目；男性77例，年龄14～79岁；女性29例，年龄17～83岁。106例患者的出院诊断显示，31例为肺结核复治患者，这些患者均有肺结核病史，曾进行抗肺结核治疗；7例患者为AIDS合并肺结核，其中2例有肺结核既往史，3例患者Xpert MTB/RIF检测为MTB阳性且CT影像提示肺结核，2例患者CT提示为陈旧性肺结核经抗肺结核治疗好后好转；其余68例为肺结核及其他诊断的患者，CT均有疑似肺结核的影像，患者均有肺结核的临床症状。

1.2仪器与试剂 主要的仪器包括GeneXpert检测系统(美国赛沛公司)、酶标仪(安图公司)、二级生物安全柜；主要的试剂包括MTB rpoB基因和突变检测试剂盒采用赛沛公司配套试剂；结核感染T细胞检测试剂盒购自北京万泰生物药业股份有限公司；结核杆菌IGg抗体试剂购自英科新创(厦门)科技有限公司产品；抗酸染色液(冷染法)购自珠海贝索生物技术有限公司。

1.3方法

1.3.1晨痰标本Xpert MTB/RIF快速检测 把样品消化液(消化液和痰液按2∶1的比例)加入盛有痰标本中痰杯内(要求患者晨痰标本合格，不少于2 mL，理想的标本量应为3～4 mL，用同一份标本做抗酸染色)，视痰标本的黏稠度调整处理液的加入量，盖上痰杯盖子，在振荡器上振荡15～30 s，室温静置10 min，再次振荡15～30 s，室温静置5 min，样品在测试之前应完全液化，无肉眼可见的痰块。取2 mL处理好的样品至反应盒中，然后将反应盒置于检测模块，仪器开始自动检测，检测耗时1 h 50 min，MTB检测结果以高、中、低、极低和未检出5个量级来表示，利福平耐药基因结果以检出和未检出表示。

1.3.2抗酸染色 按照《痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》[3]中的标准进行操作，结果以1+、2+、3+、4+和阴性表示。

1.3.3全血γ-干扰素释放试验 采集患者的空腹静脉血，置于肝素钠抗凝管中，严格按照MTB特异性细胞免疫反应试剂盒的说明书进行检测，结果以阳性或阴性报告。

1.3.4结核杆菌IgG抗体检测 采用结核杆菌IgG抗体检测试剂盒(胶体金法)进行检测，严格按照检测试剂盒的说明书进行操作，结果以阳性或阴性报告。

1.4统计学处理 采用SPSS19.5进行统计分析，阳性检出率的比较采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.14种方法检测患者痰标本 Xpert MTB/RIF高于抗酸染色、结核杆菌IgG抗体检测的阳性率，差异均有统计学意义(χ2=41.86、34.92，P<0.05)，与γ-干扰素释放试验阳性率比较差异无统计学意义(χ2=1.024，P>0.05)，见表1。4种方法检测都为阳性的患者有13例。

表1 4种检测方法的阳性率(n=106)

注：与Xpert MTB/RIF比较，*P<0.05

2.2Xpert MTB/RIF检测基因突变 106例患者晨痰标本检出14例rpoB基因突变，耐药率为19.18%(14/106)。8例探针位点为ProbeD，6例为ProbeE。

2.3Xpert MTB/RIF与抗酸染色结果的分析 Xpert MTB/RIF检测为MTB高量级的8例患者抗酸染色均为阳性；MTB中量级的37例患者中，抗酸染色阳性15例；15例MTB低量级的患者中，抗酸染色阳性2例；13例MTB极低量级的患者中，抗酸染色阳性1例；33例未检出MTB的患者抗酸染色均阴性。Xpert MTB/RIF与抗酸染色的检测结果比较，差异有统计学意义(χ2=41.86，P<0.05)，见表2。

表2 Xpert MTB/RIF与抗酸染色比较

3 讨 论

Xpert MTB/RIF是可同时进行MTB及利福平耐药性检测的自动化、全封闭检验平台。近年来，该技术被用于临床分离株、痰液标本及少数肺外结核标本MTB及利福平耐药性的检测，多项研究证实其具有灵敏度与特异度高，生物安全性好、耗时短等优点，成为WHO推荐的药敏感性分子检测技术[4-6]。

Xpert MTB/RIF快速检测MTB的半定量结果分为高、中、低、极低、未检出5个级别。本研究检出的8例MTB高量级标本抗酸染色均为阳性，抗酸染色结果为2+～3+；检出的37例MTB中量级标本中，抗酸染色阳性15例(占40.55%)，抗酸染色结果均为1+；低和极低量级标本，抗酸染色阳性检出率很低，分别是2例和1例，抗酸染色结果均为1+，说明Xpert MTB/RIF检测的量级结果与标本中MTB数量呈正相关，抗酸染色方法结果也可能与标本中MTB数量呈正相关，这与文献报道一致[18]。样本中MTB数量很低的时候抗酸染色(直接涂片法)很可能镜检找不到，MTB中量级标本如果标本处理不当或标本质量欠佳时抗酸染色(直接涂片法)镜检就可能漏检。Xpert MTB/RIF 快速检测在这些患者的临床诊治中有较高的灵敏度和特异度，与国内外研究结果也基本一致[7-9]。

中国是耐药结核病高负担国家之一，尤其是耐多药结核病，是目前临床工作中遇到的重大挑战和主要障碍[10]，根据WHO报道，80%以上对利福平耐药的结核病患者同时对异烟肼耐药，即绝大多数对利福平耐药的结核病患者为耐多药结核病患者。Xpert MTB/RIF可检测利福平耐药基因，尽早发现结核感染与耐药结核，可以为治疗与治愈结核创造机会。Xpert MTB/RIF快速检测技术还可以用于脑脊液、关节液、胃液、组织等肺外标本的检测[11-12]。

Xpert MTB/RIF核酸检测方法采用GeneXpert检测系统，是一种半巢式实时荧光定量PCR体外诊断技术，以rpoB基因为靶基因，自动提取DNA后扩增rpoB基因的192 bp片段进行检测，采用3种特异的引物和6种分子信标，同时检测6种探针，其中5个相互重叠的分子探针(分别以探针A～E命名)选择性覆盖rpoB基因的81 bp核心区，用于检测利福平耐药。

Xpert MTB/RIF技术由于检测费用高，推广普及有一定困难，不能够检测非MTB，不能区分死菌和活菌[13]，另外Xpert Mtb/RIF只能检测一种药物耐药基因，检测结果受一些特殊的利福平耐药相关基因突变的影响，例如耐多药菌株由于含有rpoB1491F突变而不能被检测出[14]。也有研究表明，rpoB533区的亮氨酸变为脯氨酸可导致假阴性的出现[15]。

γ-干扰素释放试验检测需耗时20多小时，在肺结核和肺外结核患者中的检出率较高，优于抗酸染色(直接涂片法)和结核杆菌IgG抗体检测[16]，但不能检测耐药基因，不能将既往感染和活动性肺结核进行区分。结核杆菌IgG抗体检测阳性，有可能是由注射过卡介苗的交叉反应导致。4种方法比较，Xpert MTB/RIF快速检测的检出率和指导治疗的价值均较高，与赵冰等的研究结果相似[17-18]。

4 结 论

GeneXpert MTB/RIF快速检测能提高菌含量少的痰液标本或肺结核患者抗酸染色(直接涂片法)阴性标本的MTB检出率，能尽早发现耐药结核菌，对肺结核的诊断和用药指导优于其他3种方法。