血清miR-124和miR-20a联合检测对胃癌的诊断价值研究

张晓玲,袁蒲,张征波,王小云

胃癌(gastric cancer)是常见的消化道癌，在全球范围内，其发病率和病死率在恶性肿瘤中排名第2，全世界每年新增胃癌发病者近100万人，其中相关病死率约10%[1-2]。目前，对胃癌的治疗情况以及预后、生存期等有所改善，但晚期胃癌的临床治疗结果并不满意，术后5年生存率仍然较低，并且多数患者发生肿瘤侵袭和转移，因而提高对胃癌的早期诊断可有效降低患者的病死率，改善临床治疗效果[3-4]。传统的肿瘤标志物，如癌胚抗原(CEA)，对胃癌诊断的灵敏度、特异性较低，因此，探索新的肿瘤诊断标志物，对胃癌的临床诊断至关重要[5-7]。微小RNA(microRNAs，miRNA)是一种小分子的非编码RNA，由20至25个核苷酸组成，它调节肿瘤的出现和进化，是许多生物过程中的重要因素，如增殖、分化、侵袭、凋亡、血管生成与肿瘤细胞转化上皮间充质等[8]。 循环血液系统中微小RNA被认为是癌症检测和监测中的潜在分子标记，因为它们不被RNA酶消化并且在血清和血浆中很稳定[9]。本研究中，我们应用荧光定量PCR法检测了92例胃癌患者及83例慢性胃炎患者血清中miR-20a与miR-124的应答水平，运用其研究胃癌可行性诊断，并血清癌胚测定的抗原结果比较，评价两种miRNAs用于胃癌诊断的临床应用价值。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

选取2018年5月至2019 年5月无锡市中医医院及无锡市第二人民医院住院的胃癌患者92例，均经病理组织学或细胞学检查确诊为胃癌，并且未接受过分子靶向目标的治疗、免疫学治疗、放化疗等的初诊新发病例，排除胃部转移性肿瘤患者。其中，男性58例，女性32例，年龄34～82 岁，平均(59±12.8)岁；Ⅰ期+ Ⅱ期47 例、Ⅲ期+ Ⅳ期45 例。另选取同期患有慢性胃炎的患者83例作为对照。本研究经医院伦理委员会批准，所有研究队形均签署知情同意书。

1.2 样本采集与RNA提取

采集所有患者的全血5 mL，加入促凝剂使全血完全凝固，小心吸取上层血清用1.5 mL 无RNA 酶的EP管进行分装，存于-80 ℃待用。一部分采集的血液标本送检验科，采用罗氏公司的Roche Elecsys 全自动电化学免疫分析仪对血清CEA进行检测；另一部分血清样本，按照mirvana Paris试剂盒(ambion公司、型号am1556)操作说明，从血清中提取总RNA。 通过u-2800紫外分光光度计测定RNA的纯度与浓度，并储存在超低温冰箱(-80 ℃储存)中。

1.3 定量PCR检测

根据TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit试剂盒(ABI公司)的使用说明，在体外回收提取的RNA并获得产物cDNA。 反应时的条件为：16 ℃、42 ℃时各温育30 min，在85 ℃ 加热5 min，并在4 ℃保存。以产物cDNA为模版，PCR进行荧光定量，使用Roche LightCycler 480仪器、内部参考以U6为应答检测、运用TaqMan Universal PCR Master Mix 20_l反应系统来进行，通过2-CT计算血清中microRNA-124和microRNA-20a的相对表达，反应条件为60 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，95 ℃预变性10 min，扩增40个循环。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 胃癌患者与慢性胃炎患者血清miR-124和miR-20a 的表达水平

实时荧光定量PCR检测结果显示，胃癌患者血清中miR-124显著低于慢性胃炎患者，差异有统计学意义(P<0.05)；而胃癌患者血清中miR-20a的应答水平则明显高于慢性胃炎患者，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1胃癌患者与慢性胃炎患者血清miR-124和miR-20a 表达水平比较

2.2 胃癌患者血清miR-124和miR-20a表达与临床病理特征的关系

胃癌患者血清miR-124表达与肿瘤临床分期相关(P<0.05)，下降程度随分期加重而增大，与患者性别、年龄、饮酒史和淋巴结转移无明显相关性(P>0.05)。血清miR-20a表达与肿瘤临床分期相关(P<0.05)，上升程度随分期加重而增大，与患者性别、年龄、饮酒史和淋巴结转移没有明显关联性(P>0.05),见表2。

表2血清miR-124、miR-20a表达与胃癌患者临床病理特征的关系

2.3 联合血清中miR-124、miR-20a建立风险评估模型

以是否患有胃癌为因变量(胃癌组患者赋值为1，慢性胃炎患者赋值为0)，将175例研究对象纳入统计分析，以患者的年龄、性别(男性赋值为0，女性赋值为1)、有无饮酒史(无饮酒史赋值0，有饮酒史赋值为1)、以及血清中miR-124、miR-20a检测水平为自变量，进行Logistic回归分析。分析结果发现胃癌发生与性别、年龄和饮酒史无显著相关，血清miR-20a(OR=1.387，95%CI1.144～5.102)表达水平高是发生胃癌的危险因素、miR-124(OR=0.655，95%CI0.283～0.821)表达水平高是发生胃癌的保护因素。建立胃癌风险评估模型Ln((P/(1-P)=1.779+0.327*miR20a-0.423*miR124)。

2.4 血清miR-124、miR-20a对胃癌的诊断价值

通过ROC曲线下面积来评价诊断效率，发现联合miR-124和miR-20a诊断胃癌的AUC(95% CI)为[0.907(0.867～0.948)]，明显优于癌胚抗原[0.739(0.667～0.810)]、miR-124[0.859(0.807～0.911)]和miR-20a[0.761(0.691～0.830)](P均<0.05)。miR-124和miR-20a联合诊断胃癌的敏感度和特异度较好，分别为83.7%和74.7%。见图1和表4。

表3胃癌发生相关因素的Logistic回归分析结果

图1各检测指标诊断胃癌的ROC曲线

3 讨论

1993年在真核生物中最初发现了miRNAs，后续研究表明microRNA可以通过将碱基配对互补与靶基因的3′或5′末端连合，调节靶基因的mRNA控制或分解它们来和转录基因的连合从而减少靶基因的翻译。运用基因调节的功能，mRNA可以大范围参与许多真核生物细胞内的生物反应过程，如参与细胞的分化和增殖，细胞的信号传递，细胞周期调节等[10-11]，与多类肿瘤的出现和进展也有紧密关联。所以，目前在生命科学领域内对于microRNAs有关生物的发育成长及其癌症方面关注已经成为研究的重点[12]。康博雄等人通过研究发现，miR-106a-5p在胃癌细胞系及胃癌组织中高表达并与淋巴结转移以及浸润深度有关，其有可能成为潜在研究价值的癌基因之一[13]。俞鹏飞[14]等人发现miR-210的表达与TNM分期、淋巴结转移及肿瘤大小密切相关,miR-210低表达患者5年生存率为48.2%,miR-210高表达患者5年生存率为30.4%,差异有统计学意义。表明:miR-210在胃癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织,可能与胃癌的发生、发展及预后有关。

表4各指标对胃癌的诊断价值

注：*与miR-20a + miR-124联合检测AUC比较，P<0.05

Lin M对45例胃癌患者的研究发现，患者血清miR-20 a的表达与胃癌的分化程度，淋巴结是否转移以及临床分期相关，或可作为胃癌的早期诊断指标[15]；尹晓庆等对176胃癌患者手术标本以及癌旁正常组织进行miR-124的表达检测发现，胃癌组织中miR-124的表达下调，与胃黏膜非良性转变以及淋巴结转移和分化密切相关；谢等对胃癌细胞系的研究也发现，miR-124或可通过靶向调控鞘氨醇激酶1基因的表达，从而抑制胃癌细胞的侵袭和增殖能力[16]。

miRNA在肿瘤细胞的增殖、转移、侵袭和凋亡过程中发挥着重要的调控作用。 当靶miRNA编码癌基因或抑癌基因时，miRNA的表达失调就会引起肿瘤的发生[17]。miR-124可以通过直接靶作用于丝裂原活化蛋白激酶1，抑制胃癌细胞株的增殖、迁移和侵袭，抑制其正常细胞周期，促进细胞凋亡[18]。本文通过检测胃癌患者与慢性胃炎组患者血清中miR-124、miR-20a的表达进行研究发现，在胃癌患者血清中miR-124表达水平显著下降，相比于慢性胃炎组患者差异有统计学意义(P<0.05)，其低表达很可能因其启动子区域CpG岛高度甲基化造成，并通过负调控血管内皮生长因子和丝裂原活化蛋白激酶1的表达起到抑癌基因的作用。miR-20a在绝大多数胃癌组织中均高表达，被认为是与胃癌相关的最重要的一种miRNA[19]。研究发现胃癌患者血清中miR-20a表达水平则明显升高，相比于慢性胃炎组患者差异有统计学意义(P<0.05)，程序性细胞死亡基因 4能促使细胞凋亡，是调控细胞凋亡的重要基因，miR-20a通过下调程序性细胞死亡基因 4的表达，抑制细胞凋亡，间接促进胃黏膜上皮细胞的增殖速度[15]。进一步分析胃癌患者血清中miR-124、miR-20a的表达与病患临床上的病理相关联系表明，胃癌患者的miR-20a及miR-124在血清应答水平与患者的年龄，性别，饮酒史均无相关性(P均>0.05)，但与胃癌的淋巴结转移和临床分期明显相关(P均<0.05)，与前人报道结果一致；利用SPSS软件的ROC分析，评价患者血清中miR-124、miR-20a表达对胃癌诊断的价值，与癌胚抗原的差异进行比较发现，发现联合miR-124和miR-20a诊断胃癌的AUC(95%CI)为[0.907(0.867～0.948)]明显优于癌胚抗原[0.739(0.667～0.810)]、miR-124[0.859(0.807～0.911)]和miR-20a[0.761(0.691～0.830)]。miR-124和miR-20a联合诊断胃癌的敏感度和特异度较好，分别为83.7%和74.7%。这说明血清miR-20a 和miR-124联合检测胃癌效果明显优于其他三种检测方式。

综上所述，在胃癌患者血清中miR-124、miR-20a表达变化显著，与胃癌的发生发展密切相关，由于血清标本较易获取，而且血液中miRNA分子相对稳定，是作为分子诊断的理想标志物，故而对二者在血清中的表达进行联合检测，对于胃癌的诊断有着一定的临床应用价值，但至于其进一步的临床应用，还需要扩大样本进行验证。