结直肠癌细胞多腺苷酸化元件结合蛋白1 mRNA的临床价值研究

邢慧，杨珍妮，胡小翠，刘丹

胞浆多聚腺苷序列结合蛋白1 (cytoplasmic polyadenylation element binding protein 1，CPEB 1)与位于胞浆内mRNA 3′非翻译区的多聚腺苷序列结合，参与多聚腺苷酸化并调控多种蛋白的翻译活化和抑制[1-3]。2006年发现鼠胚胎成纤维细胞缺失CPEB1即发生永生化，Burn等人证实了CPEB敲低后会出现转化细胞的特征，如长端粒保留，线粒体数量减少，呼吸减少以及糖酵解率增加；此外，CPEB下调导致p53表达降低约50%，p53 mRNA的polyA尾缩短且翻译效率下降[4]。尽管CPEB1的抑癌作用在多个组织及动物模型中有所研究，但目前为止，尚无充分、完整的数据阐述结直肠癌发生发展过程中CPEB1的作用。本研究采用实时定量PCR的方法检测CPEB1 mRNA的表达情况，探讨其与结直肠癌临床病理特征以及预后的关系，获得CPEB1表达的初步数据，以期为CPEB1作为结直肠癌的潜在治疗靶点的研究提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究得到哈尔滨医科大学伦理委员会批准,收集2005至2008年哈尔滨医科大学第二附属医院接受外科手术的221例结直肠癌患者的癌组织及30例癌旁正常组织。排除术前新辅助放化疗、复发性结直肠癌或其他已知恶性肿瘤者。收集纳入患者的一般资料，肿瘤部位、大小、病理及临床分析，并进行术后随访，评估是否出现复发及转移。

1.2 方法

1.2.1 RNA分离和定量实时PCR 采用Trizol(TIANGEN，Beijing，China)一步法提取癌组织和癌旁正常组织(距肿瘤10 cm以上的上皮组织)总RNA。使用ImProm-Ⅱ TM逆转录系统(Promega)合成cDNA，应用荧光定量PCR检测CPEB1 mRNA。 扩增应用SYBRH mRNA(TaKaRa)试剂盒，GAPDH mRNA作为对照。 CPEB1上游和下游引物序列(5′-3′)分别为：GGAAGAAGAAGCAGGAAGGAT和GCATCCTGCTTGTAA-CTGTT。以GAPDH为内对照，计算各组CPEB1 mRNA的表达水平。 最终，与配对正常组织中CPEB1 mRNA相比， 结直肠癌组织CPEB1 mRNA的表达水平分为：表达降低(比值≤1)或表达增加(比值>1)两组[5]。

1.2.2 免疫组织化学分析 应用CPEB1抗体(1∶100稀释；GTX122410，GeneTex)进行石蜡包埋的组织样品的免疫组织化学染色，应用二抗(PV-6001，ZSGB-BIO)和3， 3-氨基联苯胺(PA109；TIANGEN，北京，中国)显色。使用苏木素进行复染。免疫组化结果分别由两名不知道荧光定量PCR结果的病理专家进行阅片和评分。 根据McCarty等人报道的免疫组化染色结果评分方法进行评分，该方法综合染色强度和百分比[6]。

1.3 统计分析

统计学处理应用SPSS 17.0(SPSS，Chicago，IL)软件进行。计量资料以mean±SD表示，组间差异采用t检验； 计数资料采用百分率表示，组间差异采用2检验。相关性分析采用spearman相关性分析进行检验；根据Cox回归分析进行单变量和多变量生存分析，Kaplan-Meier法分析采用Log Rank检验。P<0.05被认为具有统计学意义。

2 结果

2.1 CPEB1 mRNA表达

本研究共纳入221例结直肠癌患者。 肿瘤组织中CPEB1 mRNA水平表达各异，其中CPEB1 mRNA表达升高(肿瘤/瘤旁比值 > 1)的中位数为1.57(n=159;范围为1.01～3.45)，CPEB1 mRNA水平降低(肿瘤/瘤旁比值 ≤ 1)的中位数为0.53(n=62;范围为0.23-1.00)。

为了确定CPEB1 mRNA水平是否与CPEB1蛋白表达一致，我们应用免疫组织化学方法(图1A和1B)检测了CPEB1 mRNA比值增高(n=20)或降低(n=10)的 30个结直肠癌样本。 结果显示，免疫组织化学染色得分与CPEB1 mRNA比值水平一致(P= 1.43×10-4)。

图1结肠癌组织CPEB1免疫组化染色(SP,×200) A：CPEM1染色阳性; B：CPEB1染色阴性

2.2 CPEB1 mRNA比值与临床病理资料分析

患者的临床和病理特征见表1。结直肠癌患者的中位年龄为63.5岁(范围28～92岁)，大部分为良好/中度分化的Ⅱ期和Ⅲ期肿瘤。 较低的CPEB1 mRNA比值与淋巴结受累显著相关。单因素分析显示CPEB1 mRNA与肿瘤大小，部位，病理类型及分化均无显著相关(见表2)。

中位随访时间为48.4个月(范围为0～95个月)，70.6%的患者生存，其中65.6%的患者无进展生存。 186例非IV期患者的中位随访时间53.7个月(范围为9～95)，其中42例(22.6%)术后出现复发或转移。与CPEB1 mRNA比值较高患者相比，较低CPEB1 mRNA比值的患者中位总生存时间显著降低(P=2×10-5, 图2A)。低CPEB1 mRNA比值是无进展生存期短的显著预测因素(PFS;P= 0.001，图2B)多变量分析显示，在调整性别、部位、病理类型、分化和肿瘤分期后，总生存期和无进展生存期与CPEB1 mRNA比值显著相关(P=2.31×10-4和P=0.002)。

表1结直肠癌患者的临床病理特征

表2CPEB1信使RNA(mRNA)水平与结直肠癌临床病理特征的相关性研究

图2Kaplan-Meier生存曲线 A：Cpeb1 mRNA的表达与纳入患者的总体生存期; B: Cpeb1 mRNA的表达与纳入患者的无进展生存期

3 讨论

多项研究表明，CPEB1通过特异性调控胞质多聚腺苷酸化参与靶基因的翻译调控[7-9]。CPEB1在细胞分裂中的M期进入和肿瘤细胞增殖中发挥重要作用，研究表明CPEB及其家族成员在肿瘤组织中表达下降，可能参与肿瘤细胞的衰老逃逸以及永生化，上皮间质转化等[10-11]。以往的研究结果提示CPEB1是一个潜在抑癌因子，CPEB1的缺失增加了肿瘤易感性。 此外，CPEB1也参与促进恶性细胞进展[12-15]。在CPEB1表达缺陷的乳腺上皮细胞由于β-连环蛋白和E-钙粘蛋白定位变化进而导致细胞失去极性，这可能导致上皮间质转化，最终肿瘤增殖和转移能力增强[11]。综上所述，CPEB1参与肿瘤的发生与发展。

表3Cpeb1 mRNA水平与结直肠癌患者无进展生存期的多因素分析

本研究中，我们发现CPEB1 mRNA比值在结直肠癌组织标本中表达不同，CPEB1 mRNA比值降低与患者总体生存和无进展生存期短相关。这为CPEB1在结直肠癌中起到一定的抑癌作用的佐证，也与之前的研究结果报道是一致的。我们的研究结果还显示，CPEB1 mRNA比值可以作为结直肠癌患者生存的良好独立预测指标。这与其他一些研究结果一致，例如Yin J、Yin XY等[16-17]的研究显示CPEB1表达低的胶质瘤患者的总体生存期显著缩短。

综上，我们的结果证明CPEB1 mRNA比值降低是结直肠癌患者预后差的独立预测因子；CPEB1可能参与了结直肠癌的发生发展过程。 然而，本实验仅为初步试验，CPEB1的表达机制、调控机制以及更深入的数据，CPEB1在结直肠癌中的作用机制和临床意义还需要更大规模的研究去证实。