不同浓度的丙泊酚对人胃癌BGC-823细胞增殖以及相关蛋白表达的影响

2019-12-13 05:16张静静
新疆医科大学学报 2019年12期
关键词:丙泊酚胃癌蛋白

张 冰,陈 杰,张静静,闫 睿,雷 钟

(新疆医科大学1附属肿瘤医院麻醉科,2第四临床医学院手术麻醉科,830011 乌鲁木齐)

目前,胃癌是临床上常见的消化道的恶性肿瘤,其发病率也是呈逐年上升的趋势,且严重的影响了患者的生活质量[1]。外科手术是早、中期胃癌最主要的治疗手段之一。然而,在肿瘤的切除过程中因手术的操作原因,会引起细胞转移至血液循环而导致了术后发生组织、器官转移[2]。丙泊酚是常用的静脉麻醉药,杨昌明等[3]研究表明一定浓度下的丙泊酚可以通过减少机体的氧化应激以及减少线粒体损伤,进而减少高糖对心肌的损伤,表明了丙泊酚是有一定的器官保护功能。丙泊酚是否对人胃癌细胞的增殖有影响目前仍不明确,该研究拟探讨丙泊酚对胃癌细胞的增殖以及相关蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞人胃癌细胞系 BGC-823 购自中国科学院的细胞库(上海)

1.2 主要试剂与仪器丙泊酚(H201506611;北京费森尤斯卡比有限公司);1640培养基胎牛血清(Gibco,美国),CCK-8试剂盒(Dojindo,日本),凋亡试剂盒(V-APC/7-AAD,联科,中国),抗体:Caspase 9(1∶1 000)和BCL-2(1∶1 000)购自美国CST公司,Cleaved caspase 3 (1∶1 000)购于华安生物,GAPDH(1∶2 000)和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔以及山羊抗小鼠IgG(1∶5 000)购自联科生物有限公司。

1.3 方法与分组依据丙泊酚的浓度进行分组,对照组(磷酸缓冲盐溶液,C组)、脂肪乳组(10 μg/mL,E组)、不同浓度的丙泊酚组(2 μg/mL,Pl组;4 μg/mL,P2组;8 μg/mL,P3组;16 μg/mL,P4组)。在不同浓度及作用时间观察胃癌BGC-823细胞增殖以及相关蛋白的表达。

1.4 细胞培养将BGC-823细胞与含有10%的胎牛血清、1%的青霉素/链霉素的1640培养基置于37℃、5% CO2的培养箱中温育,待细胞的接触率达80%至90%时,用0.25%胰酶进行消化、离心和传代。

1.5 细胞活力检测将处于对数生长期的BGC-823细胞,置于完全培养基中重悬。按 5×103个/孔的细胞密度接种于96孔板中,置于5% CO237℃培养箱里培养6 h后,按研究设计加入了等体积、指定剂量PBS、脂肪乳剂、丙泊酚溶解后再共培养。分别于24、48、72 h取出,弃去上清液以后加入100 μL/孔的培养基,每孔加入CCK-8 10 μL,在相同的条件下再继续培养上2 h,在波长450 nm处测定其吸光度值(OD值),比较细胞的增殖活性。

1.6 蛋白印迹检测根据研究设计,收集经丙泊酚处理后各组细胞,加入Ripa裂解液对细胞进行裂解,提取总蛋白,通过BCA法测定样本蛋白质浓度,加入5×蛋白上样缓冲液,通过在100℃下煮沸5 min使蛋白变性。制备10%SDS-PAGE凝胶,每孔蛋白上样量均为 40 μg 用于电泳。将蛋白转至硝酸纤维素膜上后,将5%脱脂奶粉在室温下封闭1 h,洗膜3次后加入特异性的抗体Caspase 9、Caspase 3、Bcl-2、GAPDH 等,4℃ 孵育过夜,次日取出后用TBST进行洗膜,加入辣根过氧化物酶标记的二抗,在室温下孵育1 h,再次洗膜后,滴加ECL进行膜曝光反应。蛋白条带灰度值用Quantity One软件进行分析,并比较各蛋白质表达变化。

2 结果

2.1 细胞增殖检测结果不同浓度的丙泊酚与胃癌BGC-823细胞培养24 h后,检测结果显示,与对照组(C组)相比较,E、P1、P2组OD值差异无统计学意义(P>0.05);但随着丙泊酚药物浓度的增加,P3、P4组OD值显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05),见表1。

2.2 蛋白印迹检测结果E、P1、P2、P3组与对照组(C组)相比较,Caspase-9的表达量无显著变化,差异无统计学意义(P>0.05);随着丙泊酚浓度的增加,P4组中Caspase -9的表达显著增加,差异具有统计学意义(P<0.05);E、P1、P2组与对照组(C组)相比较,Caspase -3的表达量无显著变化,差异无统计学意义(P>0.05);随着丙泊酚浓度的增加,P3、P4组中Caspase -3的表达显著增加,差异具有统计学意义(P<0.05);E、P1、P2组与对照组(C组)相比较,BCL-2的表达量无显著变化,差异无统计学意义(P>0.05),随着丙泊酚浓度的增加,P3、P4组中BCL-2的表达显著下降,差异具有统计学意义(P<0.05),见表2。

表1 不同浓度丙泊酚对胃癌细胞BGC-823 OD值的影响

表2 不同浓度丙泊酚对胃癌细胞BGC-823细胞凋亡相关蛋白表达的比较

3 讨论

丙泊酚诱导平稳、术后苏醒较迅速等特点而被广泛使用于全麻的诱导以及维持中,是实施各手术时最常用的静脉药之一[4]。有研究显示,丙泊酚除发挥静脉麻醉作用外,针对肿瘤患者还表现出一定的抗肿瘤效应[5],但该观点尚存在争议。部分报道示:丙泊酚可通过下调微小RNA、MMP-2等的表达,抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭,促进细胞凋亡[6-7]以及通过抑制NF-κB信号通路,增加吉西他滨对胰腺癌药物化疗的敏感性[8]和抑制转录因子Slug而提高紫杉醇对于卵巢癌细胞的作用[9];其可抑制肝癌、肺癌细胞增殖和促进细胞凋亡,因此可知丙泊酚对肿瘤患者有一定的治疗作用。在临床麻醉工作过程中,丙泊酚靶控浓度为3~8 μg/mL,根据前期预实验结果以及文献[10],丙泊酚的浓度选择2、4、8、16 μg/mL。丙泊酚在麻醉过程中,一方面其发挥重要的麻醉作用,另一方面根据研究结果推测可能对患者的肿瘤细胞的抑制增殖和凋亡有良好的促进作用[11]。本研究以胃癌细胞为研究对象,观察丙泊酚对其增殖以及蛋白表达的影响,结果显示,随着丙泊酚的浓度递增(>8 μg/mL),细胞的增殖及侵袭均会受到抑制。

恶性肿瘤一个重要的特征为细胞侵袭,该侵袭为多步骤、多环节的过程,受多种因素的影响。有研究显示,丙泊酚可部分下调p53基因的表达和激活Nrf2信号通路,促进肿瘤细胞增殖及迁移能力[11-12]。大量体外研究、动物模型的研究提示,丙泊酚可通过抑制多条生物信号通路和下调部分基因、蛋白表达,达到抑制肿瘤细胞生长、抑制细胞转移和促进化疗药物的敏感性目的[13]。但部分研究结果不尽相同,其可能促进肿瘤细胞的增殖与侵袭能力[11-12]。多数研究者则认为,在肿瘤细胞中其产生两种截然不同的生物学行为与各实验中所用细胞的不同特性存在着一定的相关性[14]。在细胞凋亡过程中Caspase家族起到关键性作用,Caspase-3是Caspase家族关键酶,可通过作用在蛋白因子而进一步调控细胞凋亡,是细胞在凋亡过程的效应蛋白,其活性是凋亡进入不可逆阶段的重要性标志。有研究结果显示,随着药物浓度的增加,Caspase-3、Caspase-9蛋白表达可上调,促进胃癌细胞凋亡,从而进一步的抑制胃癌细胞的增殖和转移[15],丙泊酚作用于细胞后,增加Caspase-3、Caspase-9蛋白表达,进而调节细胞增殖的过程。

白建杰等[16]通过体外研究指出,在人乳腺癌MDA-MB-231细胞中,丙泊酚可下调H19的表达而抑制细胞迁移、侵袭过程。丙泊酚组裸鼠移植瘤组织中Nrf2、NQO1、HO-1基因以及蛋白相对表达量均呈降低趋势,说明丙泊酚可能通过抑制 Nrf2/ARE 信号通路而发挥抗肿瘤作用[17]。本研究结果显示,与对照组(C组)相比较,E、P1、P2组OD值差异无统计学意义(P>0.05);但随着丙泊酚药物浓度的增加,P3、P4组OD值显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。蛋白印迹结果同样表明,随着丙泊酚药物浓度的增加,可上调Caspase-3、Caspase-9蛋白表达,同时抑制BCL-2表达,故本体外实验结果说明,随着丙泊酚药物浓度的增加,可抑制胃癌细胞的增殖,同时降低相关蛋白的表达。

综上所述,高浓度的丙泊酚可通过抑制胃癌细胞增殖,从而抑制肿瘤细胞的复发和转移,这一过程可能与丙泊酚上调Caspase -3、Caspase -9蛋白表达以及降低BCL-2表达密切有关。

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